單細胞打印加速In Vivo CAR-T抗癌新療法
隨著細胞治療領域的快速發(fā)展，In Vivo CAR-T（體內CAR-T）療法成為行業(yè)新焦點。與傳統體外制備CAR-T不同，這項技術只需向患者體內注射攜帶CAR基因的病毒載體，便能直接在體內“就地”改造T細胞，大大簡化治療流程，為患者爭取寶貴時間。
01 巨頭押注，In Vivo CAR-T站上風口
2025年，In Vivo CAR-T領域捷報頻傳：阿斯利康以總價10億美元收購EsoBiotec，將其工程化納米抗體慢病毒平臺收入囊中；艾伯維則以高達21億美元全現金收購了專注于該領域的Capstan Therapeutics。
巨頭的巨額押注，凸顯了In Vivo CAR-T的巨大潛力。相比傳統體外CAR-T，其優(yōu)勢顯著：
1 流程簡化
擺脫復雜的個體化生產流程，患者無需經歷細胞采集、體外改造、擴增回輸等漫長過程。
2 成本降低
治療成本有望大幅下降，讓更多患者受益。
專家觀點：易慕峰生物研發(fā)中心負責人郝瑞棟博士指出：“我們的全新In Vivo技術平臺，成功打破了國外企業(yè)在關鍵元件上的專利壁壘。”
臨床層面，易慕峰基于慢病毒載體的平臺已在臨床前展現出出色性能。而EsoBiotec的ESO-T01作為第1個進入人體試驗的體內BCMA CAR-T候選藥物，在復發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤患者中實現了100%的客觀緩解率，成果令人鼓舞。
表1：In Vivo與Allo CAR-T核心特點與臨床進展對比表
02 慢病毒載體：體內CAR-T的“基因快遞員”
在In Vivo CAR-T開發(fā)中，遞送系統的選擇至關重要。目前，慢病毒載體因其可實現單次給藥、靶向性強、免疫原性低且臨床經驗豐富，成為主流選擇。然而，傳統的慢病毒生產工藝面臨滴度波動大、成本高、批次一致性差等挑戰(zhàn)，難以滿足體內治療的大規(guī)模生產需求。
破解這一瓶頸的關鍵在于穩(wěn)定細胞系的開發(fā)。以深研生物的EuLV穩(wěn)轉細胞系生產系統為例，通過使用可誘導的穩(wěn)定生產細胞系，在化學成分確定的培養(yǎng)基中生產，實現了病毒產量提升近百倍、生產成本降低80%的巨大飛躍，為產業(yè)化奠定了堅實基礎。
穩(wěn)轉細胞系構建通常分為三步：
構建包裝細胞系：將慢病毒包裝基因穩(wěn)定插入宿主細胞基因組。
插入目標基因：將CAR基因穩(wěn)定插入包裝細胞系，篩選出高產、穩(wěn)定的單克隆。
規(guī)模化生產：在化學成分限定培養(yǎng)基中進行高密度懸浮培養(yǎng)，誘導生產慢病毒載體。
圖1：穩(wěn)轉細胞系構建路線圖03 單細胞打印機：篩選高產細胞系的“神助攻”
在構建穩(wěn)定細胞系的過程中，最關鍵的一步是篩選出高產、高穩(wěn)定性的單克隆細胞。而單細胞打印技術正是在這一環(huán)節(jié)發(fā)揮著“神助攻”的關鍵作用。
這項技術已在產業(yè)界得到成功驗證。例如，國際藥企葛蘭素史克（GSK）在其發(fā)表于《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》（2020）的研究中，詳細闡述了如何利用Cytena單細胞打印機，高效構建用于慢病毒載體生產的穩(wěn)轉細胞系。
該研究通過單細胞打印篩選出的高產單克隆，在搖瓶規(guī)模下生產的未濃縮慢病毒載體功能性滴度即可穩(wěn)定超過1×10⁷ TU/mL，與高效瞬時轉染的產量相當（圖2）。
圖2：在搖瓶中通過瞬時轉染和穩(wěn)定生產細胞系獲得慢病毒載體滴度圖。各點表示9個搖瓶中每個的滴度更重要的是，這些由單克隆衍生的細胞系展現出卓越的遺傳穩(wěn)定性——在連續(xù)傳代培養(yǎng)超過20個代次后，其載體滴度和整合的載體基因拷貝數均未發(fā)生顯著衰減(圖3）。
圖3：克隆在超過20個細胞倍增的過程中，功能滴度（TU/mL）和物理滴度（p24）保持穩(wěn)定。最終，該研究成功將篩選出的克隆放大至50升一次性攪拌罐生物反應器進行生產，單個批次即可收獲高達2×10¹¹總功能性TU的慢病毒載體（圖4），理論上足以滿足10名患者的治療需求。這一案例充分證明了基于單細胞打印的克隆篩選策略，是實現穩(wěn)定、高產、可規(guī)�；《旧a工藝的基石。
圖4：48小時后收獲50L批次的結果圖。未濃縮載體的功能滴度范圍為0.4 ~ 1.4 107 TUCEM/mL，感染性范圍為7 ~ 43 TUCEM/pg p24。
單細胞打印技術的核心優(yōu)勢如下：
智能篩選
可設定細胞直徑、圓度、熒光強度等多參數，真正篩選出“強壯合格”的細胞，提高單克隆形成率。
高效快速
分選一個96孔板僅需1-2分鐘，單細胞率大于95%。
操作簡便
設備無需復雜維護清洗，采用一次性無菌打印芯片，杜絕交叉污染。
精準定位
可調整液滴位置，確保液滴滴入孔板中央，細胞沉降到孔底后能輕松拍到Day0的單細胞圖片，避免ghost well問題。
證據追溯
分選過程自動拍攝多張噴嘴圖片，完整記錄單克隆來源，滿足監(jiān)管機構對單克隆源性的嚴苛要求。
04 未來可期：技術融合加速CAR-T產業(yè)化
隨著生物制藥行業(yè)對細胞系單克隆性的要求日益嚴格，單細胞打印技術的重要性將愈發(fā)凸顯。從GSK等企業(yè)的成功實踐可以看出，單細胞打印技術是產業(yè)化工藝中確�？寺≡葱�、合規(guī)性與一致性的關鍵環(huán)節(jié)。它與慢病毒生產技術的深度融合，正推動細胞治療工藝向更高效、規(guī)范、可追溯的方向發(fā)展。未來，我們有望見證更多基于In Vivo CAR-T的治療方案獲批上市，為全球癌癥患者帶來新的希望。而單細胞打印技術，將繼續(xù)作為幕后功臣，在這一進程中扮演不可或缺的角色。
參考資料：
- 2025 ASGCT | 易慕峰In Vivo體內CAR-T技術平臺重磅亮相
- In Vivo與Allo CAR-T：誰先攻克商業(yè)化堡壘？
- 體內細胞療法工藝新突破：EuLV穩(wěn)轉細胞系慢病毒載體系統高效突破LVV生產瓶頸
- Chen, Y.H., et al. (2020). Rapid Lentiviral Vector Producer Cell Line Generation Using a Single DNA Construct. Mol Ther Methods Clin Dev.
