骨髓組織空間轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)的樣本制備及步驟技巧
瀏覽次數(shù)：481 發(fā)布日期：2025-9-19
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做骨髓組織空間轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)總遇坎？
脫鈣擔(dān)心傷 RNA、切片老脫片、數(shù)據(jù)質(zhì)量上不去…… 別愁！
這份骨髓組織空轉(zhuǎn)制備實(shí)驗(yàn)流程指南來(lái)救場(chǎng)，逐步驟拆解關(guān)鍵操作，讓您的研究少走彎路！
1、骨髓組織樣本如何制備？
（1）樣本采集
骨髓組織 “新鮮度” 是 RNA 質(zhì)量的關(guān)鍵，樣本離體后需 30 分鐘內(nèi)完成固定，杜絕 RNA 降解！小鼠樣本需取股骨、脛骨等部位，沿冠狀面或矢狀面切開(kāi)以暴露骨髓；人骨髓組織樣本則要重點(diǎn)關(guān)注組織厚度，避免影響固定液滲透效果。
（2）固定環(huán)節(jié)
推薦使用 4% 多聚甲醛進(jìn)行固定，其純度高、背景信號(hào)低，不僅能減少組織收縮，對(duì)脂肪和各類(lèi)酶的固定效果也更優(yōu)，尤其適配免疫熒光、熒光原位雜交等精細(xì)實(shí)驗(yàn)。
特別注意：固定后需用流水沖洗過(guò)夜，徹底去除殘留固定液，為后續(xù)操作排除干擾。
（3）脫鈣處理
骨髓組織含鈣化成分，脫鈣是成功切片的基礎(chǔ)，建議選用 0.5M EDTA（pH7.5）溫和脫鈣，4℃條件下結(jié)合磁力攪拌或搖床處理 3-14 天，期間每 2-3 天更換一次脫鈣液。
脫鈣終點(diǎn)判斷：用尖鑷子或針尖輕戳組織，若能輕松扎透或組織明顯變軟，即可停止脫鈣，避免過(guò)度處理?yè)p傷組織。
（4）脫水與包埋
脫水步驟需用梯度乙醇（50%-100%）逐步處理，其中 70% 乙醇可在 4℃下過(guò)夜；95%、100% 等高濃度乙醇則需嚴(yán)格把控處理時(shí)間，防止組織變脆影響后續(xù)切片。
包埋時(shí)按常規(guī)石蠟包埋流程操作，但要格外注意骨髓組織的擺放方向，確保切片時(shí)能完整暴露目標(biāo)研究區(qū)域。
2、骨髓組織切片和防脫的技巧是什么？
（1）切片厚度
骨髓組織切片易脫片，建議將厚度控制在 4μm（常規(guī) FFPE 樣本多為 5μm），既能降低脫片風(fēng)險(xiǎn)，又能保障基因捕獲效率，兼顧實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性與數(shù)據(jù)質(zhì)量。
（2）防脫片技巧
- 優(yōu)先選用官方推薦的防脫載玻片，從材質(zhì)上增強(qiáng)組織與玻片的黏附力，減少脫落隱患；
- 適當(dāng)延長(zhǎng)烤片時(shí)間，讓組織與玻片貼合更緊密，提升后續(xù)操作中的穩(wěn)定性；
- 脫蠟、雜交等操作需 “溫柔進(jìn)行”，加液時(shí)放緩速度，避免液體沖擊導(dǎo)致組織脫落。
3、骨髓組織切片質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)是什么？
DV200
定義：以長(zhǎng)度＞200 核苷酸的 RNA 片段占比來(lái)衡量，可直觀反映 RNA 的完整程度。
標(biāo)準(zhǔn)：合格線(xiàn)為 DV200＞30%，一旦低于該數(shù)值，后續(xù)實(shí)驗(yàn)建議暫停或重新制備樣本。
4、總結(jié)：搞定骨髓組織空間轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)，3 個(gè)核心要點(diǎn)記牢
“優(yōu)先守護(hù) RNA”：從固定到脫鈣的全流程，都要把減少 RNA 損傷放在第一位，DV200 作為核心指標(biāo)，必須嚴(yán)格把控；
脫片問(wèn)題重點(diǎn)破：切片厚度、防脫載玻片挑選、操作時(shí)的輕柔程度，這些細(xì)節(jié)是保障數(shù)據(jù)完整的關(guān)鍵；
流程調(diào)整要靈活：依據(jù)樣本類(lèi)型（小鼠 / 人）、實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)（常規(guī)檢測(cè) / 精細(xì)分析）適配方法，別生搬硬套模板。
骨髓組織空間轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)雖有挑戰(zhàn)，但吃透這些流程和技巧，就能讓研究事半功倍！收藏這份指南，下次實(shí)驗(yàn)直接照著操作，用高質(zhì)量數(shù)據(jù)為你的科研加分！
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