基于全息成像的無標(biāo)記策略為三陰性乳腺癌研究提供新視角

三陰性乳腺癌（TNBC）因其高度侵襲性及缺乏有效靶向治療策略，構(gòu)成重大臨床挑戰(zhàn)。深入解析TNBC的細胞行為特征，對于開發(fā)新型療法具有重要意義。
 
2025年6月，美國密歇根大學(xué)迪爾伯恩分校研究團隊在《Cancer Reports》期刊上發(fā)表了一項突破性研究成果。該研究采用瑞典Phase Holographic Imaging（PHI）公司開發(fā)的HoloMonitor M4全息活細胞成像平臺，系統(tǒng)比較了非腫瘤源性乳腺上皮細胞MCF10A與三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231在細胞形態(tài)、運動性及光學(xué)厚度等多個維度的差異。基于這些數(shù)據(jù)，研究進一步結(jié)合主成分分析（PCA）和t-分布隨機鄰域嵌入（t-SNE）等高維分析方法，揭示了兩類細胞在行為模式上的根本區(qū)別，為理解癌癥進展機制提供了新的分子視角。
 
實驗方法
HoloMonitor M4 系統(tǒng)具備無需標(biāo)記即可實時成像的優(yōu)勢，使研究者能夠在維持細胞完整性的同時，全面分析細胞尺寸、運動性、形態(tài)不規(guī)則性及光學(xué)厚度等關(guān)鍵參數(shù)。該系統(tǒng)的獨特性能支持對細胞行為進行連續(xù)延時追蹤，并為后續(xù)采用主成分分析（PCA）和 t-分布隨機鄰域嵌入（t-SNE）進行高維數(shù)據(jù)分析提供可靠的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
 

HoloMonitor M4
 
1. 細胞培養(yǎng)與數(shù)字全息成像分析
實驗采用MCF10A（ATCC CRL-10317）和 MDA-MB-231（ATCC HTB-26）細胞系。MCF10A 細胞培養(yǎng)于添加了 BPE、hEGF、胰島素、氫化可的松和 GA-1000（瑞士巴塞爾 Lonza 公司）的 MEBM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中；MDA-MB-231 細胞則培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清、5% 青霉素/鏈霉素及 1 mg/mL 胰島素（美國 Gibco 公司）的 RPMI1640 培養(yǎng)基中。所有細胞均在 37℃、5% CO₂條件下培養(yǎng)至約 50% 融合度。
細胞接種24小時后，使用HoloMonitor M4系統(tǒng)以每15分鐘一次的頻率采集延時圖像，解析細胞形態(tài)的動態(tài)變化（包括面積、運動性和不規(guī)則性等參數(shù)）。通過特征特異性散點圖評估時間模式，并應(yīng)用獨立的雙樣本t 檢驗評估細胞系之間隨時間的顯著性差異。利用 PCA 和 t-SNE 方法實現(xiàn)高維數(shù)據(jù)的可視化聚類與趨勢識別。每個培養(yǎng)孔的圖像經(jīng)分割識別后，通過 HStudio 軟件的細胞計數(shù)功能確定細胞數(shù)量。
2. 數(shù)據(jù)收集與處理
通過HoloMonitor M4活細胞成像系統(tǒng)，實時無標(biāo)記地獲取細胞的多維度動態(tài)參數(shù)，包括細胞面積、形態(tài)不規(guī)則度、遷移力、運動性、遷移方向性以及光學(xué)厚度等關(guān)鍵指標(biāo)。原始數(shù)據(jù)通過pandas.read_excel()函數(shù)導(dǎo)入Python環(huán)境，并執(zhí)行數(shù)據(jù)清洗與標(biāo)準(zhǔn)化操作，以確保后續(xù)分析的準(zhǔn)確性與一致性。隨后采用主成分分析（PCA）與 t-分布隨機鄰域嵌入（t-SNE）相結(jié)合的策略進行降維分析，以揭示細胞系間的差異模式。最后，借助scipy.stats.ttest_ind()函數(shù)對兩組細胞樣本執(zhí)行雙樣本t檢驗，以量化評估其在各項特征參數(shù)上的顯著性差異。所有統(tǒng)計結(jié)果經(jīng)系統(tǒng)整合后導(dǎo)出，為后續(xù)生物學(xué)解讀提供數(shù)據(jù)支持。
 
實驗結(jié)果
 
多維尺度分析揭示致癌性與三陰性乳腺癌細胞系特征
研究結(jié)果顯示，MCF10A 和 MDA-MB-231 細胞系之間存在顯著的形態(tài)學(xué)差異。具體而言，MDA-MB-231 細胞表現(xiàn)出更強的運動性，細胞尺寸更小且變異性更高，這些特性可能增強其侵襲潛能。相比之下，MCF10A 細胞具有更大的細胞尺寸和更規(guī)則的遷移模式，提示其在組織結(jié)構(gòu)環(huán)境中保持穩(wěn)定。此外，延時成像分析進一步發(fā)現(xiàn)，MDA-MB-231 細胞的光學(xué)厚度和不規(guī)則性持續(xù)較高，這可能與其惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性有關(guān)。相關(guān)性分析進一步支持上述發(fā)現(xiàn)，揭示了細胞大小、運動性和光學(xué)特性之間的內(nèi)在聯(lián)系，這些關(guān)聯(lián)對于理解細胞在微環(huán)境中的行為具有重要意義。
 

圖1 . MCF10A與MDA-MB-231細胞系的數(shù)字全息成像
圖像展示了細胞形態(tài)的3D形貌表征，其中彩色編碼的高度圖表示光學(xué)厚度（單位：微米）。暖色調(diào)（紅色和黃色）對應(yīng)較高光學(xué)厚度區(qū)域，而冷色調(diào)（藍色）表示較低光學(xué)厚度區(qū)域。左圖為非腫瘤源性MCF10A細胞，右圖為三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞。比例尺代表100微米。這些圖像凸顯了兩種細胞系在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上的差異。
 

圖S1.（A）MCF10A與（B）MDA-MB-231細胞的數(shù)字全息顯微鏡（DHM）圖像
圖中疊加了經(jīng)計算分割的細胞邊界。細胞邊界通過基于梯度的邊緣檢測算法從原始相移圖中提取，在保持DHM無標(biāo)記成像特性的同時增強了圖像的可解釋性。本圖作為對圖1的補充，提供了更清晰的單細胞輪廓可視化效果。
 

圖2.MCF10A與MDA-MB-231細胞的主成分分析（PCA）與t-SNE分布圖
每個點代表一個細胞，黑色點表示MCF10A細胞，紅色點表示MDA-MB-231細胞。（A）PCA圖中，x軸和y軸分別代表第一和第二主成分；（B）t-SNE圖中，x軸和y軸表示t-SNE的兩個特征維度。
 
研究結(jié)論 
在區(qū)分非腫瘤源性細胞與三陰性乳腺癌（TNBC）細胞系方面，目前大部分采用流式細胞術(shù)、熒光顯微鏡或者基因檢測與蛋白質(zhì)組學(xué)等分析技術(shù)。這些方法雖能有效識別特定細胞標(biāo)志物或分子通路，但通常需要熒光標(biāo)記、基因測序或復(fù)雜的樣本前處理，這些干預(yù)可能改變細胞自然行為或限制對細胞的實時動態(tài)監(jiān)測能力。
本研究采用全息活細胞成像系統(tǒng) HoloMonitor M4，結(jié)合主成分分析（PCA）和 t-分布隨機鄰域嵌入（t-SNE）等先進數(shù)據(jù)分析策略，展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。作為一種無標(biāo)記成像技術(shù)，HoloMonitor M4可在接近生理條件下維持活細胞的完整性，實現(xiàn)對細胞運動性和形態(tài)變化等行為的長時程追蹤。這種方法不僅增強了對動態(tài)細胞過程的解析能力，還有助于在最小干擾下識別新的生物標(biāo)志物和潛在治療靶點。通過HoloMonitor M4與多變量關(guān)聯(lián)分析，本研究進一步深化了對細胞自適應(yīng)機制及其與微環(huán)境互作的理解，為揭示調(diào)控癌細胞行為的內(nèi)在與外在因素提供了重要線索。實驗不僅明確了非腫瘤源性細胞與TNBC細胞之間的本質(zhì)差異，也提示了潛在的生物標(biāo)志物與治療靶點。
隨著乳腺癌研究邁向精準(zhǔn)醫(yī)療，解析不同亞型在細胞和分子層面的特異性至關(guān)重要。本文的創(chuàng)新發(fā)現(xiàn)為理解三陰性乳腺癌的侵襲性本質(zhì)提供了新穎視角，奠定了基礎(chǔ)研究框架，對最終減輕該疾病對患者的健康危害具有重大意義。