離子通道蛋白WB實(shí)驗(yàn)的技巧及注意事項(xiàng)
引言
2021年的諾獎(jiǎng)?lì)C發(fā)給了戴維·朱利葉斯和阿登·帕塔普蒂安,以表彰他們?cè)?ldquo;發(fā)現(xiàn)溫度和觸覺(jué)感受器”方面作出的貢獻(xiàn)，主要是新的離子通道蛋白TRPV1和Piezo。之前的文章，小優(yōu)跟大家一起回顧了兩位大佬的發(fā)現(xiàn)之旅。其實(shí)，這是離子通道領(lǐng)域第三個(gè)諾獎(jiǎng)。1991年，埃爾溫·內(nèi)爾以及伯特·薩克曼由于發(fā)明膜片箝電位記錄技術(shù)，證實(shí)離子通道獲獎(jiǎng)。2003年，頒發(fā)給了發(fā)現(xiàn)水通道的彼得·阿格雷和利用X射線(xiàn)晶體成像技術(shù)展現(xiàn)離子通道結(jié)構(gòu)的羅德里克·麥金農(nóng)。
離子通道蛋白的研究方法
針對(duì)離子通道的研究逐漸涉及許多科學(xué)技術(shù)，例如電生理學(xué)，免疫學(xué)，基因工程和影像學(xué)等。隨著研究體系的發(fā)展，目前形成通過(guò)基因工程選擇特定基因，構(gòu)建文庫(kù)，過(guò)表達(dá)或者敲除等方式進(jìn)行篩選; 通過(guò)膜片鉗技術(shù)觀察電位變化；免疫學(xué)和影像學(xué)進(jìn)行后續(xù)的蛋白結(jié)構(gòu)、位置、表達(dá)水平的鑒定。其中免疫學(xué)中最常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)方法是免疫印跡(WB)，但我們發(fā)現(xiàn)在用WB研究離子通道蛋白的過(guò)程中，經(jīng)常結(jié)果不盡人意。鑒于離子通道蛋白的特性，要想WB一次成功，小優(yōu)細(xì)節(jié)君整理了如下Tips，希望能夠幫到您。
02 離子通道蛋白WB實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)
2.1 樣品類(lèi)型與蛋白特征
樣品制備是任何蛋白質(zhì)印跡 (WB) 中至關(guān)重要的第一步。您使用的制備方案取決于您計(jì)劃使用的樣品類(lèi)型和蛋白特征。
對(duì)于細(xì)胞（貼壁/懸�。悠�，建議直接用Laemmli樣品緩沖液,該方法將幾乎所有細(xì)胞蛋白質(zhì)釋放到緩沖液中。如果后續(xù)要做IP，應(yīng)該使用溫和去垢劑（Triton X-100或者NP-40）制備細(xì)胞系。對(duì)于組織樣品，例如，從心臟、腦組織和脂肪組織中提取相同蛋白質(zhì)的最佳方法不一定是相同的。通常，可以同時(shí)嘗試兩種裂解方案，比如“富集膜蛋白”或“常規(guī)制備”，最后選擇對(duì)目的蛋白最合適的方案。
此外，還需要考慮蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位（例如，質(zhì)膜蛋白和核蛋白需要不同的樣品制備方法），以及目標(biāo)蛋白是否富含脂筏等特定微結(jié)構(gòu)域(低溫下脂筏能抵抗非離子去垢劑的抽提，超聲有助于裂解過(guò)程)。當(dāng)目的蛋白豐度很低時(shí)，還需要濃縮膜組分。蛋白具有多重跨膜結(jié)構(gòu)域時(shí)，需要注意防止蛋白聚集或降解。
2.2 裂解液與裂解方式
對(duì)組織或細(xì)胞樣品進(jìn)行裂解是為了釋放目的蛋白、不同裂解緩沖液對(duì)蛋白溶解能力各不相同。現(xiàn)在裂解液市面上有很多，有RIPA，NP-40，Triton X-100，SDS等，那我們?nèi)绾稳プ鲞x擇呢？
離子通道抗體廠家Alomone不建議使用RIPA進(jìn)行裂解樣品，RIPA往往會(huì)“破壞”膜蛋白，導(dǎo)致膜蛋白降解，特別不適合多重跨膜蛋白和易降解膜蛋白。另外，RIPA 裂解液提取蛋白已被證實(shí)有10-30%的蛋白會(huì)丟失在不可溶組分中。Laemmli樣品緩沖液釋放更加全面。有些蛋白對(duì)于降解非常敏感，可以嘗試不同的樣品裂解液。
在裂解組織蛋白時(shí)，請(qǐng)注意全程需在冰上操作，裂解時(shí)需加入cocktail形式的蛋白酶體抑制劑。對(duì)于核蛋白和富含脂筏的，裂解時(shí)強(qiáng)烈建議超聲處理，可以更大程度釋放蛋白。組織勻漿時(shí)，避免使用勻漿珠，后者的放熱可能導(dǎo)致蛋白損失。裂解后測(cè)完濃度，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?br />
2.3 變性與上樣
變性時(shí)，將樣品在Laemmli 緩沖液中 70–100°C 下加熱 10 分鐘。對(duì)于細(xì)胞，通常將其加熱到 100℃。組織是更復(fù)雜的樣本，加熱到 70℃可保護(hù)最“容易”降解的蛋白質(zhì)。另外，對(duì)于多重跨膜蛋白，也不建議煮沸，可能會(huì)引起膜的聚集或者膜蛋白的降解，一般建議70℃ 10min或者37℃ 30min。對(duì)于可能形成多聚體的指標(biāo)，要確保中Laemmli 緩沖液中的還原劑有效，最好新鮮配制，DTT長(zhǎng)時(shí)間會(huì)失效，可另外補(bǔ)充。
如果樣品在冰箱里存儲(chǔ)一段時(shí)間，上樣前可在70℃煮一下，有助于得到清晰的條帶。細(xì)胞樣品建議上樣2–5x105個(gè)細(xì)胞/泳道的裂解液。由于組織裂解時(shí)有許多雜質(zhì)，上樣80–100µg組織裂解液/泳道。
2.4 電泳與轉(zhuǎn)膜
對(duì)于高分子量蛋白(HMW,分子量>150KD),電泳時(shí)Tris-Glycine 4–6% 或Tris-Acetate 3–8%凝膠是最佳選擇,也可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選擇凝膠。
HMW建議濕轉(zhuǎn),在4°C下以100 mA將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上20小時(shí)。注意此步驟至關(guān)重要,因?yàn)樗鼪Q定了傳輸?shù)挠行�。較長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移時(shí)間將提高 HMW 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的效率。
2.5 封閉與抗體稀釋
一般產(chǎn)品說(shuō)明會(huì)提供對(duì)應(yīng)抗體的最佳的實(shí)驗(yàn)條件，當(dāng)您實(shí)驗(yàn)遇到問(wèn)題，需要優(yōu)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，請(qǐng)您優(yōu)先參照產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行操作。
03 常用實(shí)驗(yàn)protocol
3.1 使用 Laemmli 樣品緩沖液制備細(xì)胞裂解液
用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞板，重復(fù)3次。(對(duì)于懸浮細(xì)胞,清洗離心后加入裂解液)
將板置于冰上并以 5 × 106細(xì)胞/ml 樣品緩沖液的比例加入預(yù)冷的樣品緩沖液(62.5 mM Tris(pH 6.8)、2%SDS、10%甘油和100mM DTT)。
用細(xì)胞刮刀刮下培養(yǎng)皿并將裂解液收集到微管中。
將樣品在100°C下煮沸5分鐘。
對(duì)煮沸的樣品進(jìn)行超聲處理5秒鐘。
將樣品在4°C下以14,000 rpm的速度離心5分鐘。
將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的微管中,并儲(chǔ)存在-80°C直至進(jìn)一步使用。
3.2 使用溫和去垢劑制備細(xì)胞裂解液
對(duì)于IP等應(yīng)用，我們建議使用溫和的去垢劑(如Triton X-100或NP-40)進(jìn)行細(xì)胞裂解。
用冰冷的PBS清洗細(xì)胞板,重復(fù)3次。(對(duì)于懸浮細(xì)胞,清洗離心后加入裂解液)
將板置于冰上并以5 ×106個(gè)細(xì)胞/ml的比例加入預(yù)冷的IP裂解液。
用細(xì)胞刮刀刮下培養(yǎng)皿并將裂解液收集到微管中。
在 4°C下將樣品在微管中搖晃30分鐘。
將樣品在 4°C下以14,000 rpm的速度離心10分鐘。
小心地將透明上清液轉(zhuǎn)移到干凈的微管中。您可以將樣品在-20°C下保存數(shù)月或立即與Laemmli樣品緩沖液混合。
3.3 富集膜蛋白制備組織裂解液
從動(dòng)物身上取出感興趣的組織,并在液氮中快速冷凍。將組織儲(chǔ)存在 -80°C 直至進(jìn)一步使用。
將冷凍組織放入5倍體積預(yù)冷的富集膜蛋白裂解液中。
用 polytron 勻漿器勻漿組織。
在 4°C下以 2,000 xg離心勻漿10分鐘,丟棄大碎片。
將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的微管中,將沉淀重懸在2倍體積的富集膜蛋白裂解液中并重新勻漿。
在4°C下以 2,000 xg離心勻漿10分鐘。將上清液與步驟e中的上清液混合。
將上清液(來(lái)自步驟e和f)在4°C下以100,000 xg離心1小時(shí)。
丟棄上清液。用2倍體積的富集膜蛋白裂解液重懸沉淀(含有組織膜)，并用 polytron勻漿器短暫勻漿。
使用Bradford方法測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。用富集膜蛋白裂解液將蛋白質(zhì)濃度調(diào)整至4 mg/ml。
將蛋白質(zhì)樣品儲(chǔ)存在-80°C直至進(jìn)一步使用。
3.4 常規(guī)制備組織裂解液
從動(dòng)物身上取出感興趣的組織/器官，并在液氮中快速冷凍。將組織/器官儲(chǔ)存在-80°C 直至進(jìn)一步使用。
將冷凍組織放入5倍體積預(yù)冷的常規(guī)組織裂解液中。
用 polytron 勻漿器勻漿組織。
在 4°C 下旋轉(zhuǎn)樣品30分鐘。
在 4°C 下以 100,000 xg離心勻漿1小時(shí)。
將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的微管中，并使用 Bradford 方法測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。使用常規(guī)組織裂解液將蛋白質(zhì)濃度調(diào)整至4mg/ml。將裂解液儲(chǔ)存在-80°C下直至進(jìn)一步使用。
好的研究依賴(lài)于穩(wěn)定高質(zhì)量的試劑,Alomone離子通道專(zhuān)家(優(yōu)寧維獨(dú)家代理)多年來(lái)一直為離子通道研究提供穩(wěn)定可靠的抗體,小分子化合物等。除了試劑,離子通道研究另一個(gè)不可或缺的工具就是—全自動(dòng)膜片鉗。
Reference：
Caterina MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD, Julius D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature 1997:389:816-824.
McKemy DD, Neuhausser WM, Julius D. Identification of a cold receptor reveals a general role for TRP channels in thermosensation. Nature 2002:416:52-58
Coste B, Mathur J, Schmidt M, Earley TJ, Ranade S, Petrus MJ, Dubin AE, Patapoutian A. Piezo1 and Piezo2 are essential components of distinct mechanically activated cation channels. Science 2010:330: 55-60
Janes, K. A. (2016). An Analysis of Critical Factors for Quantitative Immunoblotting. Sci Signal. ; 8(371): rs2. doi:10.1126/scisignal.2005966.
https://www.alomone.com/support/protocols
2021年的諾獎(jiǎng)?lì)C發(fā)給了戴維·朱利葉斯和阿登·帕塔普蒂安,以表彰他們?cè)?ldquo;發(fā)現(xiàn)溫度和觸覺(jué)感受器”方面作出的貢獻(xiàn)，主要是新的離子通道蛋白TRPV1和Piezo。之前的文章，小優(yōu)跟大家一起回顧了兩位大佬的發(fā)現(xiàn)之旅。其實(shí)，這是離子通道領(lǐng)域第三個(gè)諾獎(jiǎng)。1991年，埃爾溫·內(nèi)爾以及伯特·薩克曼由于發(fā)明膜片箝電位記錄技術(shù)，證實(shí)離子通道獲獎(jiǎng)。2003年，頒發(fā)給了發(fā)現(xiàn)水通道的彼得·阿格雷和利用X射線(xiàn)晶體成像技術(shù)展現(xiàn)離子通道結(jié)構(gòu)的羅德里克·麥金農(nóng)。
圖1 離子通道蛋白
離子通道蛋白的研究方法
針對(duì)離子通道的研究逐漸涉及許多科學(xué)技術(shù)，例如電生理學(xué)，免疫學(xué)，基因工程和影像學(xué)等。隨著研究體系的發(fā)展，目前形成通過(guò)基因工程選擇特定基因，構(gòu)建文庫(kù)，過(guò)表達(dá)或者敲除等方式進(jìn)行篩選; 通過(guò)膜片鉗技術(shù)觀察電位變化；免疫學(xué)和影像學(xué)進(jìn)行后續(xù)的蛋白結(jié)構(gòu)、位置、表達(dá)水平的鑒定。其中免疫學(xué)中最常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)方法是免疫印跡(WB)，但我們發(fā)現(xiàn)在用WB研究離子通道蛋白的過(guò)程中，經(jīng)常結(jié)果不盡人意。鑒于離子通道蛋白的特性，要想WB一次成功，小優(yōu)細(xì)節(jié)君整理了如下Tips，希望能夠幫到您。
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學(xué)科 |
主要技術(shù) |
|
電生理學(xué) |
電壓鉗位法、膜片鉗技術(shù) |
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基因工程 |
異源功能互補(bǔ),過(guò)表達(dá),基因沉默,GFP標(biāo)記、原位雜交和qPCR等 |
|
免疫學(xué) |
免疫組織化學(xué)、免疫熒光、免疫印跡和免疫電鏡等 |
|
影像學(xué) |
Ca2+拮抗熒光術(shù)、放射自顯影、X射線(xiàn)晶體成像和冷凍電鏡等 |
01 離子通道蛋白的主要特征
|
1. 具有多重跨膜結(jié)構(gòu)域 |
2. 分子量較大 |
|
3. 具有同源或異源多聚體 |
4. 結(jié)構(gòu)復(fù)雜 |
圖2 CaV2.1跨膜結(jié)構(gòu)域
02 離子通道蛋白WB實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)
2.1 樣品類(lèi)型與蛋白特征
樣品制備是任何蛋白質(zhì)印跡 (WB) 中至關(guān)重要的第一步。您使用的制備方案取決于您計(jì)劃使用的樣品類(lèi)型和蛋白特征。
對(duì)于細(xì)胞（貼壁/懸�。悠�，建議直接用Laemmli樣品緩沖液,該方法將幾乎所有細(xì)胞蛋白質(zhì)釋放到緩沖液中。如果后續(xù)要做IP，應(yīng)該使用溫和去垢劑（Triton X-100或者NP-40）制備細(xì)胞系。對(duì)于組織樣品，例如，從心臟、腦組織和脂肪組織中提取相同蛋白質(zhì)的最佳方法不一定是相同的。通常，可以同時(shí)嘗試兩種裂解方案，比如“富集膜蛋白”或“常規(guī)制備”，最后選擇對(duì)目的蛋白最合適的方案。
此外，還需要考慮蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位（例如，質(zhì)膜蛋白和核蛋白需要不同的樣品制備方法），以及目標(biāo)蛋白是否富含脂筏等特定微結(jié)構(gòu)域(低溫下脂筏能抵抗非離子去垢劑的抽提，超聲有助于裂解過(guò)程)。當(dāng)目的蛋白豐度很低時(shí)，還需要濃縮膜組分。蛋白具有多重跨膜結(jié)構(gòu)域時(shí)，需要注意防止蛋白聚集或降解。
2.2 裂解液與裂解方式
對(duì)組織或細(xì)胞樣品進(jìn)行裂解是為了釋放目的蛋白、不同裂解緩沖液對(duì)蛋白溶解能力各不相同。現(xiàn)在裂解液市面上有很多，有RIPA，NP-40，Triton X-100，SDS等，那我們?nèi)绾稳プ鲞x擇呢？
離子通道抗體廠家Alomone不建議使用RIPA進(jìn)行裂解樣品，RIPA往往會(huì)“破壞”膜蛋白，導(dǎo)致膜蛋白降解，特別不適合多重跨膜蛋白和易降解膜蛋白。另外，RIPA 裂解液提取蛋白已被證實(shí)有10-30%的蛋白會(huì)丟失在不可溶組分中。Laemmli樣品緩沖液釋放更加全面。有些蛋白對(duì)于降解非常敏感，可以嘗試不同的樣品裂解液。
在裂解組織蛋白時(shí)，請(qǐng)注意全程需在冰上操作，裂解時(shí)需加入cocktail形式的蛋白酶體抑制劑。對(duì)于核蛋白和富含脂筏的，裂解時(shí)強(qiáng)烈建議超聲處理，可以更大程度釋放蛋白。組織勻漿時(shí)，避免使用勻漿珠，后者的放熱可能導(dǎo)致蛋白損失。裂解后測(cè)完濃度，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?br />
2.3 變性與上樣
變性時(shí)，將樣品在Laemmli 緩沖液中 70–100°C 下加熱 10 分鐘。對(duì)于細(xì)胞，通常將其加熱到 100℃。組織是更復(fù)雜的樣本，加熱到 70℃可保護(hù)最“容易”降解的蛋白質(zhì)。另外，對(duì)于多重跨膜蛋白，也不建議煮沸，可能會(huì)引起膜的聚集或者膜蛋白的降解，一般建議70℃ 10min或者37℃ 30min。對(duì)于可能形成多聚體的指標(biāo)，要確保中Laemmli 緩沖液中的還原劑有效，最好新鮮配制，DTT長(zhǎng)時(shí)間會(huì)失效，可另外補(bǔ)充。
如果樣品在冰箱里存儲(chǔ)一段時(shí)間，上樣前可在70℃煮一下，有助于得到清晰的條帶。細(xì)胞樣品建議上樣2–5x105個(gè)細(xì)胞/泳道的裂解液。由于組織裂解時(shí)有許多雜質(zhì)，上樣80–100µg組織裂解液/泳道。
圖3 煮沸可能引起膜蛋白降解
2.4 電泳與轉(zhuǎn)膜
對(duì)于高分子量蛋白(HMW,分子量>150KD),電泳時(shí)Tris-Glycine 4–6% 或Tris-Acetate 3–8%凝膠是最佳選擇,也可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選擇凝膠。
HMW建議濕轉(zhuǎn),在4°C下以100 mA將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上20小時(shí)。注意此步驟至關(guān)重要,因?yàn)樗鼪Q定了傳輸?shù)挠行�。較長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移時(shí)間將提高 HMW 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的效率。
2.5 封閉與抗體稀釋
一般產(chǎn)品說(shuō)明會(huì)提供對(duì)應(yīng)抗體的最佳的實(shí)驗(yàn)條件，當(dāng)您實(shí)驗(yàn)遇到問(wèn)題，需要優(yōu)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，請(qǐng)您優(yōu)先參照產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行操作。
03 常用實(shí)驗(yàn)protocol
3.1 使用 Laemmli 樣品緩沖液制備細(xì)胞裂解液
用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞板，重復(fù)3次。(對(duì)于懸浮細(xì)胞,清洗離心后加入裂解液)
將板置于冰上并以 5 × 106細(xì)胞/ml 樣品緩沖液的比例加入預(yù)冷的樣品緩沖液(62.5 mM Tris(pH 6.8)、2%SDS、10%甘油和100mM DTT)。
用細(xì)胞刮刀刮下培養(yǎng)皿并將裂解液收集到微管中。
將樣品在100°C下煮沸5分鐘。
對(duì)煮沸的樣品進(jìn)行超聲處理5秒鐘。
將樣品在4°C下以14,000 rpm的速度離心5分鐘。
將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的微管中,并儲(chǔ)存在-80°C直至進(jìn)一步使用。
3.2 使用溫和去垢劑制備細(xì)胞裂解液
對(duì)于IP等應(yīng)用，我們建議使用溫和的去垢劑(如Triton X-100或NP-40)進(jìn)行細(xì)胞裂解。
用冰冷的PBS清洗細(xì)胞板,重復(fù)3次。(對(duì)于懸浮細(xì)胞,清洗離心后加入裂解液)
將板置于冰上并以5 ×106個(gè)細(xì)胞/ml的比例加入預(yù)冷的IP裂解液。
用細(xì)胞刮刀刮下培養(yǎng)皿并將裂解液收集到微管中。
在 4°C下將樣品在微管中搖晃30分鐘。
將樣品在 4°C下以14,000 rpm的速度離心10分鐘。
小心地將透明上清液轉(zhuǎn)移到干凈的微管中。您可以將樣品在-20°C下保存數(shù)月或立即與Laemmli樣品緩沖液混合。
3.3 富集膜蛋白制備組織裂解液
從動(dòng)物身上取出感興趣的組織,并在液氮中快速冷凍。將組織儲(chǔ)存在 -80°C 直至進(jìn)一步使用。
將冷凍組織放入5倍體積預(yù)冷的富集膜蛋白裂解液中。
用 polytron 勻漿器勻漿組織。
在 4°C下以 2,000 xg離心勻漿10分鐘,丟棄大碎片。
將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的微管中,將沉淀重懸在2倍體積的富集膜蛋白裂解液中并重新勻漿。
在4°C下以 2,000 xg離心勻漿10分鐘。將上清液與步驟e中的上清液混合。
將上清液(來(lái)自步驟e和f)在4°C下以100,000 xg離心1小時(shí)。
丟棄上清液。用2倍體積的富集膜蛋白裂解液重懸沉淀(含有組織膜)，并用 polytron勻漿器短暫勻漿。
使用Bradford方法測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。用富集膜蛋白裂解液將蛋白質(zhì)濃度調(diào)整至4 mg/ml。
將蛋白質(zhì)樣品儲(chǔ)存在-80°C直至進(jìn)一步使用。
3.4 常規(guī)制備組織裂解液
從動(dòng)物身上取出感興趣的組織/器官，并在液氮中快速冷凍。將組織/器官儲(chǔ)存在-80°C 直至進(jìn)一步使用。
將冷凍組織放入5倍體積預(yù)冷的常規(guī)組織裂解液中。
用 polytron 勻漿器勻漿組織。
在 4°C 下旋轉(zhuǎn)樣品30分鐘。
在 4°C 下以 100,000 xg離心勻漿1小時(shí)。
將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的微管中，并使用 Bradford 方法測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。使用常規(guī)組織裂解液將蛋白質(zhì)濃度調(diào)整至4mg/ml。將裂解液儲(chǔ)存在-80°C下直至進(jìn)一步使用。
好的研究依賴(lài)于穩(wěn)定高質(zhì)量的試劑,Alomone離子通道專(zhuān)家(優(yōu)寧維獨(dú)家代理)多年來(lái)一直為離子通道研究提供穩(wěn)定可靠的抗體,小分子化合物等。除了試劑,離子通道研究另一個(gè)不可或缺的工具就是—全自動(dòng)膜片鉗。
Reference：
Caterina MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD, Julius D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature 1997:389:816-824.
McKemy DD, Neuhausser WM, Julius D. Identification of a cold receptor reveals a general role for TRP channels in thermosensation. Nature 2002:416:52-58
Coste B, Mathur J, Schmidt M, Earley TJ, Ranade S, Petrus MJ, Dubin AE, Patapoutian A. Piezo1 and Piezo2 are essential components of distinct mechanically activated cation channels. Science 2010:330: 55-60
Janes, K. A. (2016). An Analysis of Critical Factors for Quantitative Immunoblotting. Sci Signal. ; 8(371): rs2. doi:10.1126/scisignal.2005966.
https://www.alomone.com/support/protocols
- 離子通道蛋白WB實(shí)驗(yàn)的技巧及注意事項(xiàng)
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