OptiMATE分液系統(tǒng)在密度梯度液制備流程中的應用
腺相關病毒（AAV）
是基因治療中強大的遞送載體。然而，在AAV組裝時，其包裝核酸序列的效率很低，導致只有一小部分病毒顆粒攜帶目標基因。富集純化這些正確組裝的病毒顆粒是下游純化工作流程中的關鍵步驟。15-60% w/v的碘克沙醇（IDX）不連續(xù)密度梯度離心是一種成熟的從細胞裂解物中純化AAV衣殼的主要方法。在實驗過程中，鋪設碘克沙醇不連續(xù)密度梯度是一項費力的工作，并且可能因操作人員的技能水平而導致結果的不穩(wěn)定性。
為了應對這一操作難題，我們開發(fā)了這套OptiMATE全自動密度梯度分液系統(tǒng)的自動化解決方案。該系統(tǒng)消除了梯度液制備中的手動步驟，包括準備儲備試劑、分液和離心管密封。OptiMATE可運行已建立的成熟方案，具有更高的一致性、準確性和易用性。
我們列出了OptiMATE自動化制備標準的IDX不連續(xù)梯度液的完整體系。同時，手動鋪設了相同梯度層的梯度液，并從以下幾方面進行對比：
- 離心管可變性；
- 梯度液折射率；
- 鋪設梯度液操作時間；
- vgs回收率。
方法
表1：用于進行IDX對照研究的離心管溶液組分
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組分 |
39 mL離心管 |
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總體積（mL） |
39 |
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樣品 |
12 |
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15% IDX（1M NaCl稀釋） |
8 |
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25% IDX |
6 |
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40% IDX |
8 |
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60% IDX |
5 |
血清型2 AAV通過三重轉染在HEK-293細胞中進行表達后。裂解細胞并離心以去除碎片。然后，使用類似于梯度分析實驗的15-60%（w/v）IDX不連續(xù)密度梯度液（表1，圖1）純化含有AAV的裂解澄清物。在自動組中，使用OptiMATE將IDX不連續(xù)密度梯度液分配到39 mL聚丙烯快封管中。每個離心管中加入2.08×1012病毒基因組（vgs）的AAV。在手動組中，使用OptiMATETM IDX制備IDX儲備溶液（15%、25%、40%和60%），然后使用注射器和鈍頭針頭通過底層法將每層梯度液分配到離心管中。自動組制備的離心管在儀器上自動進行密封，而手動組制備的離心管用無線熱封器手動封口。在Optima XPN-90超速離心機中，使用Type 70 Ti轉子中于16 °C下以63,000 rpm（407,427 xg）將離心管離心2小時。離心后，通過側面穿刺提取AAV條帶（在40%-60% IDX界面處），并使用離心旋轉過濾器進行緩沖液替換。通過qPCR（AAVPro滴定試劑盒，Takara Bio）對vgs進行定量以評估回收率。
圖1：全自動（上）與手動（下）配置15-60% w/v IDX不連續(xù)密度梯度液的AAV純化方案對比
結果
我們通過離心管的總重量和使用折射儀測量梯度液的折射率來進行對比評估。測量的離心管總重量結果表明，自動化分液和密封后,離心管之間的可變性較低（表2）。盡管手動分配的離心管的可變性也較低，但如果操作人員技能不足，可變性可能會加劇。
圖2顯示了離心管中梯度液的密度與累積體積的關系。與手動的IDX不連續(xù)梯度液相比，OptiMATE分配的IDX不連續(xù)梯度液具有較高的準確性、更清晰的界面，并且保持在移液誤差允許的范圍內。兩種方法中都存在一些層間擴散，這可歸因于界面混合和分液過程引起的擴散。
表2：手動分液和OptiMATE自動分液的離心管重量對比。誤差值為標準偏差（n=6）
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方案 |
總質量（g） |
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OptiMATE密度梯度液制備儀 |
48.86±0.07 |
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手動流程 |
48.21±0.25 |
圖2：比較OptiMATE（紅色）和手動流程（藍色）配置的梯度液的密度曲線分布情況。基于預期移液誤差的不同IDX層的預期密度理論曲線也被展示出來（淺灰色框）。綠色框標記AAV衣殼在曲線上的預期位置（在40-60% w/v界面處）。誤差范圍為標準差（n=3）
圖3比較了手動和使用OptiMATE制備離心管的時間。不考慮數(shù)學計算或方法創(chuàng)建所花費的情況下，使用OptiMATE制備兩個39mL快封管的速度明顯比手動快。雖然OptiMATE的總時間為31分鐘，手動為19分鐘（多39%），但人工操作時間從手動的31分鐘減少到OptiMATE的僅需5分鐘（減少84%），這突顯了人員時間和精力的大幅減少。隨著離心管數(shù)量的增加，手動鋪設和自動鋪設之間的時間差異將進一步擴大，這也再一次凸顯了OptiMATE系統(tǒng)并行分配和密封離心管的優(yōu)勢。
圖3：使用OptiMATE或手動鋪設兩根39毫升快封管的IDX不連續(xù)密度梯度液示意圖。制備步驟為淺灰色，分液和密封步驟為深灰色
為了評估AAV純化效率，從離心管中回收含有AAV2樣品的條帶，使用qPCR分析條帶中填充衣殼的含量（表3）。兩種純化方法回收的AAV量相差不大，并且與IDX不連續(xù)梯度液純化的預期值匹配。由于該純化的主要目標是在初步純化步驟中將AAV2衣殼與細胞雜質分離，而不是區(qū)分空衣殼和完整衣殼，因此我們僅專注于比較vgs的回收率。
表3：純化回收后的AAV2的qPCR分析結果
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方案 |
濃度（vg/ml） |
回收總量（vg） |
% vg回收率 |
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OptiMATE密度梯度液制備儀 |
1.57E+12 |
8.16E+11 |
39.24% |
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手動流程 |
1.76E+12 |
8.08E+11 |
38.84% |
結論
OptiMATE可精確分配不連續(xù)梯度液，解決了密度梯度超速離心中的兩個主要挑戰(zhàn)：勞動強度和一致性。
- 梯度液的一致密度分布和純化后AAV2 vgs的回收率共同證明了這一點。
- 操作界面簡潔方便搭配自動化和精確性的使用流程，即使是新用戶也能快速輕松的進行樣品純化。
- 設置和操作更加快速簡化了整個工作流程，同時降低了操作人員接觸化學和生物材料的風險。
- 此外，該儀器可無縫集成到現(xiàn)有的純化過程中，降低了鋪設高質量不連續(xù)密度梯度液的門檻，并提高了整體流程的效率。
