多組學分析揭示DNA低甲基化定義人組織調(diào)節(jié)性T細胞的表觀遺傳適應(yīng)性

2025年7月16日，德國雷根斯堡大學Markus Feuerer教授和美因茨大學Michael Delacher 教授團隊合作，通過整合人類皮膚組織和血液中調(diào)節(jié)性T細胞（Regulatory T cells，Treg細胞）的全基因組亞硫酸鹽測序（WGBS）、染色質(zhì)可及性測序（ATAC-seq）和轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）多組學數(shù)據(jù)，系統(tǒng)解析了人類皮膚組織和血液中Treg細胞的表觀遺傳特征。本研究發(fā)現(xiàn)皮膚Treg細胞表現(xiàn)出以DNA低甲基化為主的組織適應(yīng)性呈現(xiàn)狀態(tài)，尤其發(fā)生在轉(zhuǎn)座子元件（TE）區(qū)域。進一步研究證實，血液中CCR8+ Treg細胞在DNA甲基化模式上與皮膚Treg高度相似，但在染色質(zhì)可及性和基因表達上部分差異，提示其可能是從皮膚組織再循環(huán)至血液的Treg細胞。該研究首次利用多組學定義了人多組織Treg細胞的表觀遺傳適應(yīng)性狀態(tài)，并提出了CCR8+ Treg作為循環(huán)中組織來源Treg的甲基化標志。相關(guān)研究成果以“DNA hypomethylation traits define human regulatory T cells in cutaneous tissue and identify their blood recirculating counterparts”為題發(fā)表在免疫學相關(guān)領(lǐng)域頂刊《Nature immunology》。

英文標題：DNA hypomethylation traits define human regulatory T cells in cutaneous tissue and identify their blood recirculating counterparts
中文標題：DNA低甲基化表征定義了皮膚組織中的人類調(diào)節(jié)性T細胞，并鑒定出其血液再循環(huán)對應(yīng)物
發(fā)表時間：2025年7月16日
發(fā)表期刊：Nature immunology
影響因子：IF27.6/Q1
技術(shù)平臺：WGBS、ATAC-seq、RNA-seq
作者單位：雷根斯堡大學、美因茨大學等
DOI:10.1038/s41590-025-02210-x

組織中廣泛存在的CD4+ Treg細胞發(fā)揮著至關(guān)重要的免疫調(diào)節(jié)和再生作用，但其表觀遺傳特征和分化機制仍未闡明。本研究對人的皮膚和血液Treg細胞進行全基因組DNA甲基化分析，并將其與染色質(zhì)可及性和基因表達進行多組學關(guān)聯(lián)分析，鑒定出調(diào)控皮膚Treg細胞的組織適應(yīng)性程序。此外，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座元件亞家族是組織中Treg細胞低甲基化圖譜的主要組分。有趣的是，基于T細胞抗原受體序列和DNA低甲基化同源性，本研究分析表明，血液CCR8+ Treg細胞中可能含有再循環(huán)的人類皮膚Treg細胞，而染色質(zhì)可及性和基因表達差異分析表明，其組織適應(yīng)程序在再循環(huán)過程中發(fā)生了一定程度的逆轉(zhuǎn)。本研究結(jié)果為深入理解人類組織Treg細胞的生物學特性提供了見解，也為Treg細胞靶向治療的安全性評估提供了重要的理論依據(jù)。

研究方法
樣本來源：

• 皮膚組織Treg細胞：來自7名健康女性捐贈者的皮膚組織。
• 血液Treg細胞：從10例健康女性血小板捐贈者的白細胞減除腔中分離外周血單核細胞（PBMCs），包括CCR8+ Treg、CD45RA+ naive Treg和常規(guī)T細胞（Tconv）。
• 脂肪組織Treg細胞：來自皮下脂肪，用于驗證組織保守性。

表觀多組學測序分析：

• WGBS（全基因組亞硫酸鹽測序）：用于全基因組DNA甲基化分析，覆蓋約2.8M CpG位點，中位覆蓋度2–7×。
• ATAC-seq（染色質(zhì)可及性測序）：利用公開數(shù)據(jù)及自行生成的數(shù)據(jù)，分析染色質(zhì)開放區(qū)域。
• RNA-seq（轉(zhuǎn)錄組測序）：分析基因表達差異，部分數(shù)據(jù)來源于公開數(shù)據(jù)庫。
• 多組學整合：通過重疊DMRs、差異可及性峰值和差異表達基因，構(gòu)建“DMR–peak–gene links”關(guān)聯(lián)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

驗證分析：

• T細胞受體（TCR）追蹤：利用scRNA-seq/scTCR-seq數(shù)據(jù)，通過TCR克隆型重疊評估細胞來源同一性。
• 小鼠模型驗證：使用光轉(zhuǎn)換Kaede小鼠（Tg(CAG-Kaede)15Kgwa）追蹤皮膚Treg細胞向引流淋巴結(jié)的遷移，并結(jié)合CCR8表達分析。

結(jié)果圖形
（1）DNA低甲基化定義皮膚和血液CCR8+ Treg細胞
本研究首先通過WGBS技術(shù)對來自9例健康女性供者的血液naïve Treg細胞（CD45RA+CCR8-）、血液naïve Tconv細胞、血液CCR8+Treg細胞（CD45RA-CCR8+）、皮膚Treg細胞和皮膚Tconv細胞共5種CD4+ T細胞亞群的全基因組DNA甲基化進行深度測序分析。分析結(jié)果顯示，皮膚Treg細胞和血液CCR8+ Treg細胞的全基因組DNA甲基化水平上表現(xiàn)出顯著的DNA低甲基化表征，顯著區(qū)別于血液CD45RA+ Treg/Tconv細胞，表明這兩類細胞核心表觀遺傳程序共性。為精確定義細胞類型特異性甲基化特征，研究團隊開發(fā)"signature region"算法用于篩選甲基化差異≥0.15、連續(xù)至少3個CpG、間隔<300 bp的區(qū)域。該算法共鑒定出182,204個特異性標記區(qū)域，低甲基化特征同時存在于皮膚Treg、皮膚Tconv和血液CCR8+ Treg細胞中，且這些區(qū)域主要富集于基因間區(qū)，遠離CpG島，表明低甲基化可能主要影響非編碼調(diào)控元件。該結(jié)果首次從全基因組甲基化層面證實血液CCR8+ Treg細胞與組織Treg細胞的表觀遺傳共性。
 

a. 流式細胞術(shù)代表性圖譜顯示人類血液、脂肪和皮膚中CD4+CD127-CD25+ Treg細胞亞群的CD45RA-CCR8+ Treg細胞（左圖），以及人類血液與皮膚中CD4+ CD127-CD25+ Treg細胞亞群的CD45RA-CCR8+ Treg細胞比例。
b. 分選策略示意圖顯示從1例健康女性供者中分離血液CD45RA+ Treg細胞、血液CD45RA+ Tconv細胞、血液CCR8+ Treg細胞、皮膚Tconv細胞和皮膚Treg細胞。
c. 對來自9例健康女性供者的血液和皮膚和血液中分離的血液CD45RA+ Treg細胞（RA+ Treg細胞）、血液CD45RA+ Tconv細胞（RA+ Tconv細胞）、血液CCR8+ Treg細胞、皮膚Tconv細胞和皮膚Treg細胞進行DNA甲基化主成分分析。
d. c中供者的人類血液CD45RA+ Treg細胞、血液CCR8+ Treg細胞、皮膚Tconv細胞和皮膚Treg細胞中按基因組位置顯示的甲基化水平，以及與血液CD45RA+ Tconv細胞的差異分析。
e. 任意兩種細胞類型之間最顯著甲基化差異（紅色箭頭）提取細胞類型特征，從而篩選出特征區(qū)域。
f. e中所選細胞類型特征區(qū)域的DNA甲基化情況。
g. e中特征區(qū)域的細胞類型特征在由基因定義的基因組區(qū)間（上圖）和CpG島（下圖）中的分布。

（2）多組學揭示差異甲基化區(qū)域-染色質(zhì)開放峰-基因表達關(guān)聯(lián)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（DMR–peak–gene links）
為建立DNA甲基化與功能調(diào)控的直接聯(lián)系，研究整合WGBS數(shù)據(jù)與已發(fā)表的scATAC-seq及bulk RNA-seq數(shù)據(jù)，構(gòu)建了"DMR-peak-gene"關(guān)聯(lián)分析調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，即一個基因組區(qū)域同時存在差異甲基化、差異可及性和關(guān)聯(lián)基因差異表達。在比較血液CD45RA+ naïve Treg 和Tconv細胞，共鑒定出超3600個差異甲基化區(qū)域（DMRs），其中包含TNFRSF1B、TNFRSF9、IKZF2、IKZF4、FOXP3等經(jīng)典Treg功能基因。進一步整合形成了151個DMR–peak–gene links，涉及73個基因。

在Treg表征位點（如FOXP3、TIGIT、IL2RA、CTLA4、TNFRSF1B）上，WGBS揭示的低甲基化模式與ATAC-seq檢測的染色質(zhì)開放及RNA-seq檢測的高表達呈現(xiàn)顯著負相關(guān)。此外，研究通過靶基因亞硫酸鹽測序技術(shù)，在6例獨立男性供者中驗證了FOXP3、TIGIT、IL2RA、TNFRSF1B、LRRN3和SYTL3等位點的甲基化差異。這些關(guān)聯(lián)分析揭示了甲基化變化如何通過染色質(zhì)可及性調(diào)控基因表達，為理解Treg細胞功能調(diào)控提供了多組學證據(jù)鏈。
 

a. 血液CD45RA+ Treg細胞（RA+ Treg細胞）與血液CD45RA+ Tconv細胞（RA+ Tconv細胞）之間差異甲基化區(qū)域（左）、差異可及性peaks（中）和差異表達基因（右）的甲基化、染色質(zhì)可及性和表達。
b. DMR–peak–gene關(guān)聯(lián)分析（n=151）中差異甲基化、可及性和表達之間的相關(guān)性。
c. 血液CD45RA+ Treg細胞和血液CD45RA+ Tconv細胞中選定DMR–peak–gene關(guān)聯(lián)的平滑甲基化（左上）、原始甲基化（右上）、染色質(zhì)可及性（左下）和表達（右下）。
d. Taregt-BS測序顯示選定區(qū)域血液CD45RA+ Treg細胞與血液CD45RA+ Tconv細胞的甲基化差異。

（3）皮膚Treg細胞組織適應(yīng)具有多組學特征
為研究皮膚Treg細胞的組織特異性適應(yīng)過程，研究團隊鑒定出300,199個DMRs（其中298,457個為低甲基化）、8,914個差異可及性峰（3,192個高開放）和6,877個差異表達基因（4,049個高表達）。通過DMR-peak-gene關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)1,203個三聯(lián)關(guān)聯(lián)中，813個表現(xiàn)為低甲基化-高開放-高表達模式，涉及TNFRSF8（CD30）、RELB、CCR8、PRDM1和BATF等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。WGBS數(shù)據(jù)顯示，這些DMR甲基化水平變化程度遠高于染色質(zhì)可及性變化，提示DNA甲基化可能是促進組織適應(yīng)的"主開關(guān)"。功能富集分析表明，低甲基化關(guān)聯(lián)基因顯著富集于IL-2-STAT5信號、TNF信號、TGFβ信號等Treg細胞核心通路。值得注意的是，將皮膚Treg特征與脂肪組織Treg數(shù)據(jù)交叉驗證，發(fā)現(xiàn)脂肪Treg細胞中共有絕大多數(shù)低甲基化特征，證明了WGBS鑒定的表觀遺傳適應(yīng)程序在不同組織的Treg細胞間具有保守性。該結(jié)果揭示，組織Treg細胞的適應(yīng)過程本質(zhì)上是一個以DNA去甲基化為主導的大規(guī)模表觀遺傳重編程事件，而非簡單的轉(zhuǎn)錄因子誘導表達。
 

a. 皮膚Treg細胞與血液CD45RA+ Treg細胞（血液RA+ Treg細胞）之間差異甲基化區(qū)域（左）、差異可及性峰（中）和差異表達基因（右）的甲基化、染色質(zhì)可及性和表達情況。
b. DMR–peak–gene關(guān)聯(lián)（n=1,203個）中差異甲基化、可及性和基因表達之間的相關(guān)性。
c. 所選DMR–peak–gene關(guān)聯(lián)分析顯示在皮膚Treg細胞和血液CD45RA+ Treg細胞中的平滑甲基化（左上）、原始甲基化（右上）、染色質(zhì)可及性（左下）和基因表達（右下）。
d. 多組學分析顯示皮膚Treg細胞特征中基因的標記基因集富集情況。

（4）bZIP和bHLH motif的甲基化模式標記皮膚Treg細胞
通過解析DMRs中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，研究發(fā)現(xiàn)在皮膚Treg細胞低甲基化DMRs和高可及性峰中，bZIP轉(zhuǎn)錄因子（如BATF、Jun-AP1）的結(jié)合motifs中顯著富集。而bHLH轉(zhuǎn)錄因子（如c-Myc、n-Myc、USF1）motif僅富集于低甲基化DMRs，未在可及性峰值中富集。這些結(jié)果表明，bZIP因子可能在皮膚Treg細胞適應(yīng)中同時受甲基化與可及性調(diào)控，而bHLH因子可能受甲基化調(diào)控進而發(fā)揮功能。

為驗證這些低甲基化位點功能，研究選取MLPH和GNA11位點的c-Myc結(jié)合位點，運用CRISPR激活系統(tǒng)（CRISPRa）進行靶向激活，結(jié)果顯示這兩個基因表達顯著上調(diào)，驗證了c-Myc結(jié)合位點低甲基化與鄰近基因（如MLPH、GNAI1）表達上調(diào)的相關(guān)性。這一功能實驗直接證明WGBS鑒定的低甲基化區(qū)域具有增強子活性，且其調(diào)控作用依賴于精確的甲基化狀態(tài)。
 

（5）血液CCR8+ Treg細胞與皮膚Treg細胞的DNA甲基化模式相似
研究將血液CCR8+ Treg細胞與皮膚Treg與血液naïve Treg的甲基化譜進行重疊分析，發(fā)現(xiàn)在97%的DMRs中，CCR8+ Treg細胞的甲基化水平更接近皮膚Treg細胞。然而，在染色質(zhì)可及性（約60%）和基因表達（約45%）譜中，相似性顯著降低。這種"甲基化-可及性-表達"的梯度遞減現(xiàn)象提示，再循環(huán)Treg細胞在離開組織后，血液CCR8+ Treg細胞可能保留了組織Treg的甲基化“記憶”，但在循環(huán)過程中的部分可及性與表達程序被逆轉(zhuǎn)。

對BATF、PREX1和SPRED2等位點的進一步分析顯示，盡管這些區(qū)域的甲基化狀態(tài)在CCR8+ Treg中維持低水平，但染色質(zhì)開放狀態(tài)未維持，已趨近初始Treg，揭示甲基化作為更穩(wěn)定表觀遺傳標記的特性。小鼠Kaede光轉(zhuǎn)化實驗進一步證實，65%的遷出皮膚引流淋巴結(jié)的Treg細胞表達CCR8，而原位Treg僅30%表達，從體內(nèi)動態(tài)角度驗證了CCR8+ Treg細胞的組織來源。該結(jié)果為確定血液CCR8+ Treg細胞作為組織駐留Treg細胞的循環(huán)對應(yīng)物提供了證據(jù)。
 
（6）轉(zhuǎn)座元件（TF）低甲基化是組織Treg細胞的標記
轉(zhuǎn)座子元件（TE）在人類基因組中占比約40–50%，常被DNA甲基化沉默。本研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚Treg細胞中，SINE、LTR、DNA等TE亞家族（如LTR18B、HUERS-P2-int、MIR、L2a）在低甲基化DMRs中顯著富集。直接分析TE插入位點水平顯示，皮膚Treg細胞中LTR、SINE、DNA類TE的甲基化水平顯著低于血液CD45RA+ Treg。這些TE插入位點常位于TNFRS8、PREX1、PRDM1、BATF等皮膚Treg特征基因內(nèi)部或鄰近區(qū)域，提示TE低甲基化可能通過調(diào)控鄰近基因表達參與組織適應(yīng)性。

將血液CCR8+ Treg細胞納入比較后，發(fā)現(xiàn)這些細胞同樣富集TE低甲基化特征，且程度與皮膚Treg類似，但未在可及性中富集，進一步支持TE低甲基化是組織Treg細胞的穩(wěn)定表觀遺傳印記。
 
（7）TE亞家族在皮膚Treg細胞中獲得RNA表達
為驗證TE低甲基化是否導致其轉(zhuǎn)錄激活，研究進一步發(fā)現(xiàn)，部分TE亞家族在皮膚Treg細胞中轉(zhuǎn)錄上調(diào)，HERVIP10F-int和LTR45B在皮膚Treg細胞中顯著高表達。甲基化數(shù)據(jù)顯示，這兩個TE亞家族的插入位點在皮膚和脂肪Treg細胞中均呈現(xiàn)顯著低甲基化，且在血液CCR8+ Treg細胞中同樣保守。表1列出了5個最顯著低甲基化的HERVIP10F-int和LTR45B插入位點，其中，染色體4上的一個HERVIP10F-int插入位點在皮膚Treg中甲基化降低達74%。這表明TE不僅是低甲基化的被動載體，還可能通過轉(zhuǎn)錄活性參與Treg細胞的組織適應(yīng)調(diào)控。該結(jié)果不僅為TE參與免疫調(diào)控提供了人類原代細胞證據(jù)，也暗示TE再激活可能是組織Treg細胞獲得組織修復功能的分子基礎(chǔ)之一。
  表1：與皮膚Treg細胞低甲基化DMR重疊的低甲基化最顯著HERVIP10F-int和LTR45B插入位點位置及甲基化水平

結(jié)論和啟示
本研究建立了人類多組織Treg細胞高分辨率DNA甲基化圖譜，揭示以全基因組低甲基化和TE再激活為核心的組織適應(yīng)性程序，并多層次證實血液CCR8+ Treg細胞是組織駐留Treg的再循環(huán)對應(yīng)物。主要結(jié)論包括：
（1）DNA甲基化是定義組織Treg細胞身份穩(wěn)定表觀遺傳標記；
（2）TE低甲基化是組織Treg特征的重要組分；
（3）血液CCR8+ Treg細胞保留組織甲基化記憶，但轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)狀態(tài)部分恢復初始樣特征；
（4）靶向CCR8+ Treg細胞的治療需謹慎評估對組織穩(wěn)態(tài)的影響。

WGBS作為本研究中全基因組DNA甲基化圖譜的核心關(guān)鍵技術(shù)：1.鑒定出組織與血液Treg細胞的甲基化差異；2.發(fā)現(xiàn)TE區(qū)域的廣泛低甲基化；3.通過甲基化相似性推斷細胞起源與遷移關(guān)系；4.整合多組學數(shù)據(jù)建立DMR–peak–gene調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。該技術(shù)在此類研究中的優(yōu)勢在于其全面性與分辨率，未來可廣泛適用于追溯細胞發(fā)育與遷移軌跡、解析復雜組織中細胞亞型的表觀遺傳異質(zhì)性和發(fā)現(xiàn)非編碼區(qū)域（如TE）在細胞功能中的調(diào)控作用等。

參考文獻：
Beumer N,et al. DNA hypomethylation traits define human regulatory T cells in cutaneous tissue and identify their blood recirculating counterparts. Nat Immunol. 2025 Jul 16. doi: 10.1038/s41590-025-02210-x.