微量WGBS揭示DNA甲基化調(diào)控斑馬魚造血干細(xì)胞發(fā)育的表觀遺傳機(jī)制

2025年11月19日，山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院艾康博士為第一作者，山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院李雷教授和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院王璐研究員為共同通訊作者， 合作研究了脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育中造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞（HSPCs）的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。具體而言，研究團(tuán)隊(duì)以斑馬魚為模型，結(jié)合微量全基因組亞硫酸鹽測序（WGBS）和轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）技術(shù)，系統(tǒng)解析了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3ba在造血內(nèi)皮細(xì)胞（HECs）向HSPCs轉(zhuǎn)化（EHT）過程中的核心作用。

研究發(fā)現(xiàn)，Dnmt3ba通過調(diào)控整聯(lián)蛋白（integrin）（itga3b和itga7）的DNA甲基化水平，影響下游Akt/Mdm2/P53信號(hào)通路，從而維持造血內(nèi)皮細(xì)胞（HEC）存活，保障HSPC正常發(fā)育。研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）來源的人造血分化體系中驗(yàn)證了DNMT3B功能的高度保守性，揭示了"Dnmt3ba-Integrin-Akt-Mdm2-P53"軸作為調(diào)控EHT的關(guān)鍵表觀遺傳-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)耦合機(jī)制。該研究不僅深化了對(duì)HSPC發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理解，也為體外功能性HSC的生成提供了新的靶點(diǎn)和策略。相關(guān)研究成果以“DNA methyltransferase Dnmt3ba-mediated epigenetic modulation of Integrin signaling is essential for hematopoietic stem and progenitor cell development”為題發(fā)表于《Communications Biology》期刊。易基因科技為本研究提供微量WGBS技術(shù)服務(wù)助力揭示DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3ba在斑馬魚造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞發(fā)育中的關(guān)鍵作用。

（DOI：10.1038/S42003-025-09003-W）

本研究證明了在造血內(nèi)皮細(xì)胞（HECs）中高表達(dá)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3ba（Dnmt3ba）在斑馬魚中對(duì)調(diào)控HEC存活具有關(guān)鍵作用。Dnmt3ba缺失導(dǎo)致itgα3b和itgα7位點(diǎn)發(fā)生低甲基化，降低了整聯(lián)蛋白表達(dá)以及下游Akt信號(hào)傳導(dǎo)和Mdm2磷酸化，同時(shí)通過上調(diào)P53活性觸發(fā)HEC凋亡。同時(shí)，研究者在iPSC來源的人造血分化系統(tǒng)中進(jìn)行DNMT3B處理發(fā)現(xiàn)功能保守性�？傮w而言，本研究揭示了由Dnmt3ba通過表觀遺傳調(diào)控整聯(lián)蛋白（integrin）信號(hào)來協(xié)調(diào)HEC存活。

研究方法
1、模型構(gòu)建：

• 斑馬魚胚胎：CRISPR/Cas9構(gòu)建dnmt3ba、itga3b、itga7突變體，Morpholino（MO）敲低基因表達(dá)，雙熒光標(biāo)記系特異性標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）和HECs。
• 人iPSC造血分化模型：模擬人確定性造血過程，驗(yàn)證基因功能保守性。

2、功能挽救實(shí)驗(yàn)：

• 熱激誘導(dǎo)表達(dá)：構(gòu)建全長和缺失DNA甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域質(zhì)粒，通過Tol2轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)整合至基因組。24 hpf熱激1小時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)，評(píng)估36 hpf時(shí)HSPC標(biāo)記cmyb恢復(fù)情況。
• 內(nèi)皮特異性挽救：使用fli1a啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)dnmt3ba在ECs中特異性表達(dá)，驗(yàn)證細(xì)胞自主性。

3、多組學(xué)分析：

• 微量WGBS：對(duì)分選的HEC（約5000細(xì)胞）進(jìn)行全基因組甲基化測序，識(shí)別差異甲基化區(qū)域（DMRs）。 重點(diǎn)分析啟動(dòng)子（轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 kb）和基因體（gene body）區(qū)域的DMRs。
• RNA-seq：Smart-seq2方法分析HEC轉(zhuǎn)錄組，整合WGBS數(shù)據(jù)挖掘甲基化-表達(dá)關(guān)聯(lián)基因。

4、功能驗(yàn)證：

• 體外激活A(yù)kt信號(hào)（AKT2 CA mRNA）或抑制P53（p53 MO），挽救HEC凋亡表型。
• TUNEL染色、Western blot、qRT-PCR驗(yàn)證細(xì)胞凋亡和信號(hào)通路變化。
• 人源驗(yàn)證：在iPSC分化體系中敲低DNMT3B，通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估iHSPC生成效率。

圖1：Dnmt3ba對(duì)EHT和HSPC發(fā)育至關(guān)重要

（3）Dnmt3ba的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性是HSPC發(fā)育的關(guān)鍵
使用DNMT3B抑制劑Nanaomycin A處理胚胎或構(gòu)建甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域缺失突變體（dnmt3baΔDCM），均導(dǎo)致HSPC標(biāo)志物cmyb表達(dá)下降（圖2）。挽救實(shí)驗(yàn)中，僅全長Dnmt3ba可恢復(fù)突變體表型，證明其功能依賴甲基化活性。內(nèi)皮特異性挽救部分恢復(fù)HSPC生成，表明Dnmt3ba在ECs中自主發(fā)揮作用。這些發(fā)現(xiàn)共同確立了Dnmt3ba通過其催化活性調(diào)控HSPC發(fā)育的分子基礎(chǔ)，為后續(xù)探索其下游靶基因提供了因果鏈。

圖2：Dnmt3ba的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性參與HSPC發(fā)育

（4）dnmt3ba缺失型造血內(nèi)皮細(xì)胞（HECs）的轉(zhuǎn)錄組分析
為解析Dnmt3ba調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)，研究對(duì)約5000個(gè)分選的HECs進(jìn)行RNA-seq。差異表達(dá)分析鑒定出790個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs）（321個(gè)上調(diào)，469個(gè)下調(diào)），提示Dnmt3ba主要作為轉(zhuǎn)錄激活因子。KEGG富集分析揭示下調(diào)基因顯著富集于"ECM-受體互作"和"黏著斑"通路，而上調(diào)基因富集于"P53信號(hào)通路"和"細(xì)胞凋亡"通路，提示Dnmt3ba缺失導(dǎo)致HEC黏附能力受損并觸發(fā)凋亡程序。qRT-PCR驗(yàn)證促凋亡基因cdkn1a、gadd45bb和casp8的上調(diào)，TUNEL實(shí)驗(yàn)揭示dnmt3ba-/-胚胎中HEC凋亡率顯著升高，證實(shí)P53介導(dǎo)的凋亡是表型核心機(jī)制，表明Dnmt3ba通過抑制凋亡維持HEC存活。該轉(zhuǎn)錄組分析為WGBS靶基因篩選提供了功能線索，特別是將Integrin信號(hào)與細(xì)胞凋亡關(guān)聯(lián)起來，為后續(xù)機(jī)制研究指明了方向。

圖3：dnmt3ba缺失的HEC轉(zhuǎn)錄組分析

（5）整聯(lián)蛋白（Integrin）相關(guān)基因受Dnmt3ba介導(dǎo)的DNA甲基化調(diào)控
對(duì)約5000個(gè)HECs進(jìn)行WGBS后，差異甲基化分析顯示dnmt3ba突變體中hypo-DMRs數(shù)量遠(yuǎn)超hyper-DMRs，且主要富集于基因體區(qū)域，這與DNMT3B在哺乳細(xì)胞中偏好活躍轉(zhuǎn)錄基因體的特性一致。整合WGBS與RNA-seq數(shù)據(jù)，篩選出38個(gè)基因體低甲基化且表達(dá)下調(diào)的候選基因，其中itgα3b、itgα7和lamb2顯著富集于ECM-受體互作通路。qRT-PCR證實(shí)itgα3b和itgα7在dnmt3ba缺失HECs中表達(dá)顯著降低。為驗(yàn)證甲基化變化，研究使用靶基因甲基化測序?qū)�WGBS鑒定的DMRs進(jìn)行驗(yàn)證：在itgα3b和itgα7基因體CpG島，dnmt3ba突變體甲基化率較對(duì)照組顯著下降。更關(guān)鍵的是，對(duì)比ECs與HECs發(fā)現(xiàn)，野生型HECs中這兩個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平顯著高于ECs，表明Dnmt3ba介導(dǎo)的基因體甲基化具有HEC特異性，參與維持itgα3b/itgα7高表達(dá)。研究進(jìn)一步在dnmt3ba-/-胚胎中過表達(dá)itgα3b+itgα7雙基因，成功挽救HSPC缺失，確立二者為Dnmt3ba下游功能性效應(yīng)分子。至此，研究建立起"Dnmt3ba→基因體甲基化→itgα3b/itgα7表達(dá)→Integrin信號(hào)→HSPC發(fā)育"的完整因果鏈。

圖4：dnmt3ba缺失降低Integrin信號(hào)基因的甲基化和表達(dá)水平。

（6）Itga3b和Itga7參與Dnmt3ba調(diào)控的HSPC發(fā)育
敲低或突變itga3b/itga7后，HEC和HSPC數(shù)量減少（圖5），雙敲低呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，表明二者功能互補(bǔ)。CRISPR/Cas9構(gòu)建的itgα3b-/-和itgα7-/-突變體進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)論。挽救實(shí)驗(yàn)表明外源表達(dá)itga3b/itga7 mRNA可恢復(fù)HEC數(shù)量和HSPC生成，表明Dnmt3ba通過協(xié)同調(diào)控兩個(gè)Integrin α亞基來維持HEC命運(yùn)。

圖5：itgα3b/itgα7缺失介導(dǎo)胚胎中HSPC發(fā)育障礙。

（7）Dnmtα3b/Integrin/Akt/Mdm2/P53軸調(diào)控HEC存活和HSPC發(fā)育
機(jī)制上，itga3b/itga7缺失抑制Akt磷酸化和Mdm2活化，導(dǎo)致P53積累并引發(fā)HEC凋亡（圖6A-H）。激活A(yù)kt或抑制P53均可挽救dnmt3ba突變體的HSPC缺陷（圖6I-M），證實(shí)該信號(hào)軸是Dnmt3ba調(diào)控HEC存活的核心通路。值得注意的是，RNA-seq中FoxO信號(hào)通路和細(xì)胞骨架調(diào)控基因也發(fā)生改變，提示可能存在其他平行通路，但Akt-Mdm2-P53軸是核心存活機(jī)制。該發(fā)現(xiàn)將表觀遺傳調(diào)控與經(jīng)典信號(hào)整合，揭示了EHT過程中"表觀-信號(hào)-存活"的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，為理解HSPC發(fā)育失敗提供了完整邏輯鏈。

圖6：Integrin信號(hào)通過調(diào)控Akt和P53通路，調(diào)控HSPC發(fā)育

（8）DNMT3B在人確定性造血發(fā)育中的功能保守
跨物種保守性驗(yàn)證是機(jī)制研究向臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。在人iPSC造血分化體系中，DNMT3B在iHE細(xì)胞和iHSPCs中高表達(dá)。siRNA敲低DNMT3B后，iHE細(xì)胞中ITGA3和ITGA7表達(dá)下降，而促凋亡基因CDKN1A、GADD45B、CASP8上調(diào)，與斑馬魚表型高度一致。流式分析顯示，DNMT3B敲低導(dǎo)致iHSPCs（CD34+CD90+CD49f+CD38-CD45RA-）比例顯著降低，表明其功能從斑馬魚到人均保守。這一驗(yàn)證不僅強(qiáng)化了研究結(jié)論的普適性，也確立了人EHT過程中"DNMT3B-Integrin-存活信號(hào)"軸的存在，為體外HSC生成提供了潛在分子靶點(diǎn)。

圖7：DNMT3B敲低在體外人體iPS細(xì)胞造血分化過程中破壞iHSPC生成

結(jié)論和啟示
本研究系統(tǒng)闡釋了Dnmt3ba通過基因體甲基化激活整聯(lián)蛋白（integrin）信號(hào)、維持HEC存活的新機(jī)制，強(qiáng)調(diào)了不同DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（如Dnmt1、Dnmt3bb.1）在HSPC發(fā)育中的功能特異性。且DNMT3B-Integrin軸在斑馬魚、小鼠和人中功能保守，是造血譜系的古老調(diào)控模塊。

參考文獻(xiàn)：
Ai K, Wu Y, Liang G, Kong H, Yang X, Li N, Liu Z, Dong Y, Xu J, Zhang L, Chen X, Fu Y, Wang L, Li L. DNA methyltransferase Dnmt3ba-mediated epigenetic modulation of Integrin signaling is essential for hematopoietic stem and progenitor cell development. Commun Biol. 2025 Nov 19;8(1):1612. doi: 10.1038/s42003-025-09003-w.