流式抗體染色操作流程（含表面/胞內(nèi)）

流式抗體指可以應(yīng)用于流式實(shí)驗(yàn)的抗體，與ELISA、WB、IF等實(shí)驗(yàn)抗體相比，通常不需要過(guò)于復(fù)雜的樣本處理和實(shí)驗(yàn)步驟，同時(shí)檢測(cè)的是活細(xì)胞或者固定細(xì)胞，可以獲得單細(xì)胞多參數(shù)的定量結(jié)果。流式抗體又分為未標(biāo)記的和熒光標(biāo)記的，未標(biāo)記的流式抗體需要配合相應(yīng)二抗使用，熒光標(biāo)記的流式抗體自帶熒光不需要二抗。尚恩生物提供的流式抗體是經(jīng)過(guò)熒光標(biāo)記，可以直接與處理后的樣本進(jìn)行孵育，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，若需未標(biāo)記的流式抗體，可以聯(lián)系銷(xiāo)售人員咨詢。

流式抗體染色流程

 

一、細(xì)胞表面染色操作流程

1、細(xì)胞計(jì)數(shù)

將培養(yǎng)好的細(xì)胞收集于15mL離心管并計(jì)數(shù)；若為貼壁細(xì)胞，需要先用胰酶消化細(xì)胞，300g離心5min，去上清。

2、制備單細(xì)胞懸液

將收集的細(xì)胞用1mL 預(yù)冷0.5%BSA/PBS溶液重懸，300g離心5min，去上清，重復(fù)2次；用0.5%BSA/PBS溶液重懸細(xì)胞至濃度1x10⁷個(gè)細(xì)胞/mL，取100μL細(xì)胞懸液置于流式管內(nèi)。

3、（可選）阻斷Fc受體

可用抗體同源血清全I(xiàn)gG抗體與細(xì)胞充分混勻，室溫孵育10-20min。

4、一抗孵育

每管加入稀釋后的一抗溶液100μL，2-8℃反應(yīng)30min，孵育期間每隔10min晃動(dòng)一下反應(yīng)管，使細(xì)胞和抗體充分反應(yīng)。若為直標(biāo)抗體，需要避光反應(yīng)，跳到步驟7。抗體稀釋液為0.5%BSA/PBS溶液。

5、洗滌

300g離心5min，去上清后加入200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復(fù)兩遍。

6、二抗孵育

對(duì)于非熒光染料直標(biāo)抗體，加入100μL熒光二抗重懸，避光2-8℃反應(yīng)30min，孵育期間每隔10min晃動(dòng)一下反應(yīng)管。

7、洗滌

300g離心5min，去上清后加入200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復(fù)兩遍。

8、上機(jī)分析

用200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸細(xì)胞，4℃保存，上機(jī)分析。

二、細(xì)胞胞內(nèi)染色操作流程

1、細(xì)胞計(jì)數(shù)

將培養(yǎng)好的細(xì)胞收集于15mL離心管并計(jì)數(shù)；若為貼壁細(xì)胞，需要先用胰酶消化細(xì)胞，300g離心5min，去上清。

2、制作單細(xì)胞懸液

將收集的細(xì)胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，300g離心5min，去上清，重復(fù)2次；用0.5%BSA/PBS溶液重懸細(xì)胞至濃度1x10⁷個(gè)細(xì)胞/mL，取100μL細(xì)胞懸液置于流式管內(nèi)，300g離心5min去上清。

3、固定

每管加入100μL細(xì)胞固定劑重懸細(xì)胞，2-8°孵育20min。固定劑可用4% 多聚甲醛。

4、洗滌

600g離心5min，去上清后加入200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復(fù)兩遍。

5、通透

每管加入100μL細(xì)胞通透劑重懸細(xì)胞，室溫孵育20min。通透劑可用0.5%BSA/PBS（0.3%TritonX-100）

6、洗滌

600g離心5min，去上清后加入200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復(fù)兩遍。

7、（可選）阻斷Fc受體

用抗體同源血清全I(xiàn)gG抗體與細(xì)胞充分混勻，室溫10-20min。

8、一抗孵育

每管加入稀釋后的一抗溶液100μL，2-8℃反應(yīng)30min，孵育期間每隔10min晃動(dòng)一下反應(yīng)管，使細(xì)胞和抗體充分反應(yīng)。若為直標(biāo)抗體，需要避光反應(yīng)，跳到步驟11�？贵w稀釋液為0.5%BSA/PBS溶液。

9、洗滌

600g離心5min，去上清后加入200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復(fù)兩遍。

10、二抗孵育

對(duì)于非熒光染料直標(biāo)抗體，加入100μL熒光二抗重懸，避光2-8℃反應(yīng)30min，孵育期間每隔10min晃動(dòng)一下反應(yīng)管。對(duì)于直標(biāo)抗體直接跳到步驟11。

11、洗滌

600g離心5min，去上清后加入200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復(fù)兩遍。

12、上機(jī)分析

用200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸細(xì)胞，4℃保存，上機(jī)分析。

注：

實(shí)驗(yàn)建議設(shè)置空白對(duì)照，同型對(duì)照，空白對(duì)照不加一抗，同型對(duì)照將一抗替換為同型抗體。