鐵死亡的核心特征、信號通路機(jī)制及檢測方法

2012 年 Dixon 團(tuán)隊首次明確鐵死亡的核心定義：一種鐵離子依賴性的非凋亡性調(diào)節(jié)性細(xì)胞壞死。其核心機(jī)制為鐵離子與活性氧協(xié)同誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，且在形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特征及基因調(diào)控層面，均與凋亡、壞死、自噬等傳統(tǒng)細(xì)胞死亡形式存在顯著差異。值得注意的是，鐵死亡可被特異性小分子抑制劑（如 Fer-1）有效阻斷，而傳統(tǒng)壞死抑制劑對此類調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡無抑制作用。

一、形態(tài)學(xué)變化：

鐵死亡的核心特征及本質(zhì)： 
1、超微形態(tài)學(xué)特征：電鏡下可觀察到鐵死亡細(xì)胞的典型形態(tài)改變：細(xì)胞膜出現(xiàn)斷裂與出泡；線粒體呈現(xiàn)體積縮小、膜密度增高、嵴結(jié)構(gòu)減少或消失、外膜斷裂等特征；細(xì)胞核大小維持正常，且無染色質(zhì)凝聚現(xiàn)象。其中，線粒體體積縮小與雙層膜密度增高是鐵死亡較為特異的形態(tài)標(biāo)識。

2、生物學(xué)特征：鐵死亡的核心生物學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)鐵離子與活性氧（ROS）大量聚集，進(jìn)而激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號系統(tǒng)。其關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)包括：抑制胱氨酸-谷氨酸交換體（system Xc⁻）降低胱氨酸攝取，導(dǎo)致谷胱甘肽（GPX4的關(guān)鍵底物）耗竭；同時升高還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶活性，促進(jìn)ROS生成；此外還會釋放花生四烯酸等炎癥相關(guān)介質(zhì)，放大死亡信號。

3、免疫學(xué)特征：鐵死亡過程中會激活損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）信號通路，釋放高遷移率族蛋白B1（HMGB1）等前炎癥介質(zhì)，啟動局部炎癥反應(yīng)，這也是鐵死亡區(qū)別于其他細(xì)胞死亡方式的免疫特征之一。 

4、基因調(diào)控特征：鐵死亡的發(fā)生受多類基因嚴(yán)密調(diào)控，核心調(diào)控基因包括：核糖體蛋白L8（RPL8）、鐵反應(yīng)元件結(jié)合蛋白2（IREB2）、ATP合成酶F0復(fù)合體亞基C3（ATP5G3）、三四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域35（TTC35）、檸檬酸合成酶（CS）、酰基輔酶A合成酶家族成員2（ACSF2）；同時，鐵代謝與儲存相關(guān)基因（TFRC、ISCU、FTH1、FTL、SLC11A2）也通過調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)參與鐵死亡進(jìn)程。

鐵死亡的本質(zhì)：鐵死亡的本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化物代謝障礙：在鐵離子催化作用下，脂質(zhì)氧化物發(fā)生異常累積，打破細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，通過攻擊細(xì)胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子，最終觸發(fā)細(xì)胞死亡。

二、信號通路：

鐵死亡的發(fā)生受細(xì)胞內(nèi)多重信號通路嚴(yán)密調(diào)控，核心包括鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)通路、RAS 信號通路及胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)通路。其核心機(jī)制在于膜脂修復(fù)關(guān)鍵酶 —— 谷胱甘肽過氧化物酶（GPX4）功能失效，導(dǎo)致膜脂活性氧自由基（ROS）異常累積，而這一過程需鐵離子全程參與。
 

多種小分子物質(zhì)與外界條件可誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生：小分子化合物 erastin 通過抑制質(zhì)膜上的胱氨酸 - 谷氨酸交換體（system Xc⁻），減少細(xì)胞對胱氨酸的攝取，進(jìn)而阻礙 GPX4 的底物 —— 谷胱甘肽（GSH）的合成，最終引發(fā)膜脂 ROS 蓄積并觸發(fā)鐵死亡；另一種小分子 RSL3 則直接靶向抑制 GPX4 活性，同樣可誘導(dǎo)鐵死亡。此外，GPX4 基因敲除小鼠會因腎衰竭死亡，進(jìn)一步證實(shí) GPX4 在維持細(xì)胞存活、抑制鐵死亡中的關(guān)鍵作用。

   

三、檢測方法：
1、新陳代謝相關(guān)檢測

（1）細(xì)胞活性檢測：采用 CCK-8 法，可快速定量評估鐵死亡過程中細(xì)胞的存活狀態(tài)；

（2）細(xì)胞內(nèi)鐵水平檢測：借助 PGSK 探針（細(xì)胞膜透性染料），通過流式細(xì)胞術(shù)或共聚焦顯微鏡進(jìn)行活細(xì)胞實(shí)時監(jiān)測，鐵死亡細(xì)胞中 PGSK 的綠色熒光信號會顯著減弱；

（3）活性氧（ROS）水平檢測：利用 C11-BODIPY 探針檢測，該探針在鐵死亡細(xì)胞內(nèi)會發(fā)生熒光顏色轉(zhuǎn)變，由紅色特異性轉(zhuǎn)化為綠色，直觀反映 ROS 累積情況；

（4）關(guān)鍵分子表達(dá)檢測：通過 QPCR（核酸水平）或 Western Blot（蛋白水平），檢測鐵死亡相關(guān)特征因子的表達(dá)變化 ——COX-2、ACSL4、PTGS2、NOX1 等因子表達(dá)上調(diào)，GPX4、FTH1 等因子表達(dá)下調(diào)。

  

2、形態(tài)學(xué)觀察

（1）細(xì)胞超微形態(tài)觀察：通過透射電鏡直接觀察，鐵死亡細(xì)胞典型特征為線粒體體積縮小、線粒體膜密度增高；

（2）線粒體膜電位檢測：采用 TMRE 染色，通過流式細(xì)胞儀收集并分析 TMRE 陽性細(xì)胞比例，反映線粒體膜電位變化；

（3）線粒體形態(tài)動態(tài)觀察：向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染 LifeAct-GFP 熒光蛋白，結(jié)合有絲分裂追蹤器，實(shí)時觀察鐵死亡過程中線粒體的形態(tài)演變

 

 

四、研究進(jìn)展：

1、細(xì)胞鐵死亡與腫瘤的關(guān)聯(lián)研究

研究表明，不同腫瘤對鐵死亡的敏感性存在顯著差異，其中腎癌、白血病對鐵死亡的敏感性顯著高于肺癌、結(jié)腸癌等實(shí)體瘤。 p53作為經(jīng)典抑癌基因，以往研究多聚焦其通過誘導(dǎo)細(xì)胞衰老、程序性凋亡抑制腫瘤的核心作用；而近年研究揭示，p53在調(diào)控細(xì)胞代謝及鐵死亡過程中同樣扮演關(guān)鍵角色：在正常細(xì)胞中，p53可負(fù)向調(diào)控脂質(zhì)合成與糖酵解通路，同時正向調(diào)控氧化磷酸化及脂質(zhì)分解代謝，這種代謝調(diào)控模式使其傾向于正向誘導(dǎo)鐵死亡；而腫瘤細(xì)胞中常見的突變型p53則呈現(xiàn)功能逆轉(zhuǎn)，通過正向調(diào)控脂質(zhì)合成與糖酵解，顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對鐵死亡的敏感性。這一發(fā)現(xiàn)為靶向鐵死亡的腫瘤治療提供了重要理論支撐，尤其為攜帶p53突變的腫瘤治療開辟了新方向。

 

 
2、細(xì)胞鐵死亡與腦卒中的關(guān)聯(lián)研究

在缺血性腦卒中的病理進(jìn)程中，Tau蛋白功能失調(diào)被證實(shí)與年齡依賴性鐵介導(dǎo)的神經(jīng)毒性密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，大腦中動脈阻塞（MCAO）模型可顯著抑制3月齡小鼠腦半球的Tau蛋白功能，并導(dǎo)致腦內(nèi)鐵離子水平異常升高；而在野生型小鼠中，通過鐵螯合劑干預(yù)可有效阻斷鐵離子升高，提示Tau蛋白可能通過調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)發(fā)揮抑制鐵死亡的保護(hù)作用。 進(jìn)一步研究顯示，12月齡Tau基因敲除小鼠中出現(xiàn)了明顯的年齡依賴性鐵積累，這一現(xiàn)象直接抵消了Tau敲除本身對MCAO誘導(dǎo)的局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)效應(yīng)，從正反兩方面證實(shí)了Tau蛋白通過調(diào)控鐵死亡通路參與缺血性腦卒中病理機(jī)制的核心作用。

 

3、細(xì)胞鐵死亡與肝臟損傷的關(guān)聯(lián)研究

該研究通過構(gòu)建多種基因敲除小鼠模型，首次明確證實(shí)：高鐵狀態(tài)及遺傳性血色病引發(fā)的鐵過載，可特異性誘導(dǎo)肝臟組織（含肝細(xì)胞與巨噬細(xì)胞）發(fā)生鐵死亡。同時，研究還揭示了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Slc7a11調(diào)控鐵死亡的全新分子機(jī)制，為肝臟損傷、遺傳性血色病等重大疾病的防治提供了創(chuàng)新性理論依據(jù)與潛在干預(yù)靶點(diǎn)。

Wang H，et al.Hepatology.2017

 

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