克隆胚胎DNA羥甲基化動(dòng)態(tài)及功能解析體細(xì)胞重編程障礙機(jī)制
2025年11月18日，安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院梁丹教授團(tuán)隊(duì)和中國科學(xué)院動(dòng)物研究所郭帆研究員團(tuán)隊(duì)合作，首次系統(tǒng)繪制了小鼠體細(xì)胞核移植（SCNT）克隆胚胎植入前發(fā)育完整階段的全基因組5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）動(dòng)態(tài)圖譜，并通過聯(lián)合全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）、APOBEC偶聯(lián)表觀遺傳測(cè)序（ACE-seq）及RNA測(cè)序（Smart-seq2）等多組學(xué)技術(shù)，共同揭示了5hmC異常修飾模式在克隆胚胎發(fā)育障礙中的關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，SCNT胚胎在2細(xì)胞期呈現(xiàn)出一種獨(dú)特的"類精子但減弱"的親本等位基因?qū)ΨQ性5hmC分布模式，這一特征顯著區(qū)別于自然受精胚胎的親本不對(duì)稱模式；雌性克隆胚胎X染色體5hmC沉積顯著不足，而生殖印記控制區(qū)（gICRs）則表現(xiàn)出去甲基化（5hmC相關(guān)）抵抗。此外，進(jìn)一步的TET3過表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明，TET3過表達(dá)介導(dǎo)5hmC水平異常升高，從而導(dǎo)致發(fā)育相關(guān)基因過早激活并嚴(yán)重阻礙克隆胚胎發(fā)育。該研究不僅闡明了5hmC在體細(xì)胞重編程中的精確調(diào)控機(jī)制，也為提升哺乳動(dòng)物克隆效率提供了新的理論靶點(diǎn)。相關(guān)研究成果以“5-Hydroxymethylcytosine Dynamics Reveals Coordinated Reprogramming of Parental Genomes and X Chromosome Dosage Balance in Mouse SCNT Embryos“為題發(fā)表于《Advanced Science》期刊。
標(biāo)題：5-Hydroxymethylcytosine Dynamics Reveals Coordinated Reprogramming of Parental Genomes and X Chromosome Dosage Balance in Mouse SCNT Embryos（5-羥甲基胞嘧啶動(dòng)態(tài)揭示小鼠SCNT胚胎親本基因組的協(xié)同重編程與X染色體劑量平衡）
發(fā)表時(shí)間：2025年11月18日
發(fā)表期刊：Advanced Science
影響因子：IF14.1/Q1
技術(shù)平臺(tái)：WGBS、ACE-seq、Smart-seq2
作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、中國科學(xué)院動(dòng)物研究所
DOI：10.1002/ADVS.202509682
這一研究以體細(xì)胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transfer，SCNT）胚胎表現(xiàn)出以DNA甲基化異常為主要表征的廣泛表觀遺傳突變?yōu)榉较�，發(fā)現(xiàn)DNA 5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）參與早期胚胎發(fā)育過程中的甲基化重編程。研究團(tuán)隊(duì)通過系統(tǒng)性地繪制了小鼠SCNT胚胎親本等位基因的特異性全基因組5hmC圖譜發(fā)現(xiàn)2細(xì)胞期供體體細(xì)胞的雙親本基因組短暫性獲得類似正常受精胚胎中父本基因組的對(duì)稱性羥甲基化模式，但整體信號(hào)明顯較弱且快速消退；尤其是在母本基因組克隆胚胎中，X染色體羥甲基化嚴(yán)重不足，而多個(gè)關(guān)鍵生殖印記控制區(qū)（germline imprinting control regions，gICRs）表現(xiàn)出較強(qiáng)去甲基化抵抗的模式。盡管新生5hmC生成與體細(xì)胞-受精卵轉(zhuǎn)換過程中的初始DNA去甲基化密切相關(guān)，但其與持續(xù)的甲基化變化隨后發(fā)生解耦。有趣的是，通過Tet3過表達(dá)提升全局5hmC水平會(huì)導(dǎo)致發(fā)育有關(guān)基因在2細(xì)胞期過早激活，從而導(dǎo)致SCNT胚胎發(fā)育失敗不良結(jié)局。這些發(fā)現(xiàn)通過揭示SCNT胚胎中異常5hmC重編程的獨(dú)特動(dòng)態(tài)及其功能結(jié)局，完善哺乳動(dòng)物克隆胚胎發(fā)育過程精準(zhǔn)的DNA羥甲基化調(diào)控的相關(guān)機(jī)制。
研究方法
胚胎模型構(gòu)建：以雜交小鼠（C57BL/6J × PWK/PhJ）的E13.5胎鼠成纖維細(xì)胞（MEFs）為核供體，構(gòu)建SCNT胚胎，并分階段（2細(xì)胞期、4-8細(xì)胞期、囊胚期）收集樣本。
多組學(xué)測(cè)序技術(shù)：
功能驗(yàn)證：通過TET3過表達(dá)（mTet3-plus mRNA注射）提升5hmC水平，觀察其對(duì)發(fā)育的影響。
數(shù)據(jù)整合：整合WGBS和ACE-seq數(shù)據(jù)，精準(zhǔn)量化5mC/5hmC/未修飾胞嘧啶比例。
結(jié)果圖形
（1）SCNT胚胎發(fā)育過程中的5hmC全基因組圖譜
本研究首先構(gòu)建了SCNT胚胎從供體MEF至囊胚期發(fā)育過程中的完整5hmC動(dòng)態(tài)圖譜（圖1A）。通過整合WGBS與ACE-seq數(shù)據(jù)，研究者發(fā)現(xiàn)整體5hmC水平在2細(xì)胞期出現(xiàn)顯著峰值，隨后在4-8細(xì)胞期逐漸下降，至囊胚期達(dá)最低點(diǎn)，呈現(xiàn)"先升后降"的獨(dú)特動(dòng)態(tài)模式（圖1B-C）。具體而言，在體細(xì)胞-受精卵轉(zhuǎn)換（SZT）期間，高5hmC CpG位點(diǎn)比例及基因本體（gene body）區(qū)域的5hmC信號(hào)均顯著增強(qiáng)。值得注意的是，SCNT胚胎的DNA甲基化動(dòng)態(tài)表現(xiàn)為"去甲基化-de novo甲基化-二次去甲基化"的雙波模式，與5hmC的"單峰"模式形成鮮明對(duì)比（圖1C）。研究進(jìn)一步將78,732個(gè)差異羥甲基化區(qū)域（DhMR）分為四類：25,516個(gè)新生成5hmC位點(diǎn)、2,820個(gè)丟失5hmC位點(diǎn)、15,737個(gè)持續(xù)高5hmC位點(diǎn)及34,659個(gè)持續(xù)低5hmC位點(diǎn)（圖1D）�；蚪M特征分析顯示，新生成及穩(wěn)定高5hmC區(qū)域顯著富集于增強(qiáng)子、基因本體及H3K36me3/H3K27ac/H3K4me3修飾區(qū)域（圖1E-F），這表明5hmC沉積偏好轉(zhuǎn)錄活躍的調(diào)控元件。
圖1：SCNT胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞核5hmC的全基因組動(dòng)態(tài)圖譜
（2）5hmC參與SCNT胚胎第一次DNA去甲基化
研究深入探究了5hmC與5mC動(dòng)態(tài)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)5hmC與5mC在SZT轉(zhuǎn)換階段（MEF至2細(xì)胞期）存在特異性負(fù)相關(guān)（圖2D-E）。在2細(xì)胞期，發(fā)生去甲基化的DMRs伴隨顯著的5hmC生成，而維持高甲基化的區(qū)域則未見5hmC積累（圖2B-C）。值得注意的是，這種耦聯(lián)關(guān)系在后續(xù)發(fā)育階段（2細(xì)胞至4-8細(xì)胞期、4-8細(xì)胞至囊胚期）完全消失，5hmC水平在不同甲基化動(dòng)態(tài)區(qū)域間無差異。ACE-seq研究證實(shí)第一次去甲基化與5hmC生成緊密相關(guān)，而第二次去甲基化及de novo甲基化則不依賴于5hmC調(diào)控。
（3）SCNT胚胎生殖印記控制區(qū)的5hmC動(dòng)態(tài)
17個(gè)母本gICRs分析顯示，SCNT胚胎在2細(xì)胞至4-8細(xì)胞期維持高甲基化狀態(tài)，但在囊胚期第二次去甲基化中出現(xiàn)顯著5hmC非依賴性印記丟失（圖3A-B）。相關(guān)性分析驗(yàn)證結(jié)果揭示gICRs甲基化與5hmC水平在母本等位基因上無顯著關(guān)聯(lián)（圖3C-D），表明印記區(qū)域存在特殊的保護(hù)機(jī)制抵抗TET3介導(dǎo)的氧化。上述研究結(jié)果表明gICRs去甲基化機(jī)制不依賴于羥甲基化動(dòng)態(tài)變化。
（4）SCNT胚胎親本基因組X染色體的5hmC積累
X染色體劑量補(bǔ)償分析揭示了SCNT胚胎最顯著的性別特異性缺陷（圖4A）。在2細(xì)胞期，雌雄胚胎的常染色體5hmC水平在親本等位基因間對(duì)稱分布，但X染色體5hmC顯著低于常染色體；雌性胚胎的親本X染色體5hmC顯著低于常染色體和雄性胚胎的單一母本X染色體（圖4B）。該現(xiàn)象排除了MEF供體細(xì)胞的遺傳繼承（圖4E），證實(shí)是SZT重編程過程中5hmC生成不足所致。值得注意的是，SCNT胚胎Xist基因在雌性中顯著異常高表達(dá)（圖4C），但X染色體/常染色體轉(zhuǎn)錄比例在雌雄間無差異（圖4D），提示不足的5hmC可能通過維持高甲基化（圖4G）來促進(jìn)Xist異常激活，這可能破壞X染色體劑量補(bǔ)償機(jī)制。與野生型（WT）2細(xì)胞期胚胎相比，WT中X染色體5hmC水平與常染色體相當(dāng)（圖4F），揭示SCNT胚胎X染色體的"羥甲基化缺陷"具有克隆特異性。
（5）異常5hmC分布與SCNT發(fā)育障礙的相關(guān)性
比較SCNT與WT胚胎發(fā)現(xiàn)，盡管受精卵5hmC起始水平低于體細(xì)胞，WT在2細(xì)胞期胚胎5hmC總量仍顯著高于SCNT（圖5A），表明重編程效率不足。SCNT特異性高甲基化在4-8細(xì)胞期尤為突出（圖5A）。通過整合已發(fā)表WT胚胎數(shù)據(jù)，研究鑒定出四類DhMRs：SCNT特異區(qū)、WT特異區(qū)、共有高5hmC區(qū)和共有低5hmC區(qū)（圖5B）。其中，SCNT特異5hmC區(qū)域羥甲基化升高，且伴隨比WT更高的甲基化水平，提示"不完全重編程"狀態(tài)�；蚪M特征分析顯示，兩類細(xì)胞特異性DhMRs均富集于增強(qiáng)子（圖5C），且SCNT特異增強(qiáng)子關(guān)聯(lián)基因顯著下調(diào)，而WT特異增強(qiáng)子關(guān)聯(lián)基因富集于細(xì)胞命運(yùn)決定、模式形成等早期發(fā)育通路（圖5D-E）。
通過RNA測(cè)序Smart-seq2提供的高靈敏度轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與ACE-seq測(cè)序繪制的增強(qiáng)子5hmC信號(hào)圖譜進(jìn)行鄰近關(guān)聯(lián)分析，共鑒定出779個(gè)SCNT特異基因和1,047個(gè)WT特異基因。這種多組學(xué)聯(lián)用策略揭示，SCNT胚胎并非整體5hmC缺失，而是在關(guān)鍵發(fā)育增強(qiáng)子上"異位不足"，導(dǎo)致ZGA（合子基因組激活）相關(guān)發(fā)育程序未能正常啟動(dòng)，從而導(dǎo)致發(fā)育失敗。
（6）SCNT胚胎親本等位基因特異性5hmC動(dòng)態(tài)
等位基因分辨率分析揭示了SCNT胚胎發(fā)育失敗的特異性模式（圖6A-B）。WT在2細(xì)胞期胚胎父本基因組5hmC達(dá)13.3%，母本僅2.69%，呈現(xiàn)典型不對(duì)稱分布；而SCNT的雌雄胚胎均表現(xiàn)為親本等位基因?qū)ΨQ（約4-5%）（圖6A）。在100 kb基因組范圍內(nèi)上，SCNT雙親本基因組的5hmC水平與彼此高度線性相關(guān)，且整體分布模式類似WT父本基因組但強(qiáng)度減弱（圖6C-D）。t-SNE降維分析顯示，SCNT 2細(xì)胞親本基因組聚類于WT父本基因組附近，而遠(yuǎn)離WT母本基因組（圖6E），表明無論DNA來源，卵胞質(zhì)促進(jìn)了"類精子"重編程。DNA甲基化分析顯示類似對(duì)稱性，且SCNT基因組從MEF到2細(xì)胞的甲基化水平和分布與WT精子到2細(xì)胞的父本基因組變化呈強(qiáng)線性相關(guān)，但去甲基化程度普遍更低。
（7）高5hmC破壞SCNT胚胎表觀遺傳譜
為驗(yàn)證5hmC功能，研究在SCNT胚胎中過表達(dá)mTet3-plus突變體（圖7A）。免疫熒光證實(shí)HA標(biāo)簽蛋白表達(dá)（圖7B），整體5hmC水平在2細(xì)胞期升至11.49%，遠(yuǎn)高于對(duì)照的4.13%（圖7C），且高5hmC CpG比例及親本等位基因信號(hào)均顯著增加。分析發(fā)現(xiàn)43,736個(gè)位點(diǎn)發(fā)生5hmC新生成，其中33,380個(gè)為"異位生成"（即在正常SCNT中不羥甲基化）（圖7D）。這些新生成位點(diǎn)強(qiáng)烈富集于增強(qiáng)子、H3K27me3/H3K36me3修飾區(qū)（圖7E）。去甲基化DMRs在過表達(dá)組中5hmC顯著升高（圖7F），驗(yàn)證了高5hmC與去甲基化正相關(guān)。然而，即使整體5hmC提升，親本基因組仍保持對(duì)稱性（圖7G），且雌性X染色體5hmC仍顯著低于常染色體（圖7H），說明X染色體抵抗不可單純通過TET3活性增強(qiáng)而克服。值得注意的是，過高5hmC并未改善SCNT胚胎發(fā)育，反而加劇阻滯，提示5hmC并非"越多越好"，其時(shí)空分布精確性至關(guān)重要。
（8）異位5hmC生成導(dǎo)致基因過早激活并阻礙SCNT胚胎發(fā)育潛能
mTet3-plus過表達(dá)胚胎中，母本gICRs在2細(xì)胞期出現(xiàn)印記丟失（圖8A），而正常SCNT中此過程延遲至囊胚期，說明異位5hmC可突破印記保護(hù)。在SCNT中沉默/低表達(dá)且在過表達(dá)基因組中激活，且啟動(dòng)子區(qū)5hmC異位生成伴去甲基化的胚胎中鑒定出雌性597個(gè)、雄性753個(gè)異常再激活基因（圖8D）。GO分析顯示這些基因富集于"模式特化"、"區(qū)域化"、"成骨化"等原腸運(yùn)動(dòng)后事件（圖8E-F），表明2細(xì)胞期不應(yīng)表達(dá)的晚期發(fā)育基因被過早激活。發(fā)育追蹤顯示，無論100、200或500 ng/μL劑量，mTet3-plus過表達(dá)均顯著降低2細(xì)胞分裂率及囊胚形成率（圖8G）。研究最終證明，5hmC的"精準(zhǔn)調(diào)控"而非"整體提升"是SCNT成功的關(guān)鍵，異位羥甲基化會(huì)時(shí)序錯(cuò)亂地激活發(fā)育程序，導(dǎo)致胚胎在合子基因組激活（ZGA）階段即失去發(fā)育協(xié)調(diào)性。
本研究通過創(chuàng)新的多組學(xué)技術(shù)整合，系統(tǒng)闡明了5hmC是小鼠SCNT胚胎重編程的關(guān)鍵表觀障礙，其異常表現(xiàn)為"時(shí)間錯(cuò)位、空間錯(cuò)誤、劑量失準(zhǔn)"。主要結(jié)論包括：
（1）SCNT胚胎在2細(xì)胞期建立了一種非生理的親本等位基因?qū)ΨQ5hmC分布，喪失自然受精中父本特異性高羥甲基化模式；
（2）雌性X染色體5hmC嚴(yán)重不足是導(dǎo)致劑量補(bǔ)償失敗的重要原因；
（3）印記區(qū)對(duì)5hmC介導(dǎo)的去甲基化具有抵抗性，但在囊胚期發(fā)生延遲性印記丟失；
（4）5hmC生成與第一次DNA去甲基化耦聯(lián)，但后續(xù)解耦，提示重編程存在一個(gè)關(guān)鍵時(shí)間窗口；
（5）全局提升5hmC水平反而導(dǎo)致發(fā)育基因過早激活和胚胎致死，證實(shí)精準(zhǔn)調(diào)控的必要性。
參考文獻(xiàn)：
Xiang Z, Yan R, Guo J, Wang M, Cheng X, Zhang F, Guo T, Long X, Guo F, Liang D. 5-Hydroxymethylcytosine Dynamics Reveals Coordinated Reprogramming of Parental Genomes and X Chromosome Dosage Balance in Mouse SCNT Embryos. Adv Sci (Weinh). 2025 Nov 18:e09682. doi: 10.1002/advs.202509682.
標(biāo)題：5-Hydroxymethylcytosine Dynamics Reveals Coordinated Reprogramming of Parental Genomes and X Chromosome Dosage Balance in Mouse SCNT Embryos（5-羥甲基胞嘧啶動(dòng)態(tài)揭示小鼠SCNT胚胎親本基因組的協(xié)同重編程與X染色體劑量平衡）
發(fā)表時(shí)間：2025年11月18日
發(fā)表期刊：Advanced Science
影響因子：IF14.1/Q1
技術(shù)平臺(tái)：WGBS、ACE-seq、Smart-seq2
作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、中國科學(xué)院動(dòng)物研究所
DOI：10.1002/ADVS.202509682
這一研究以體細(xì)胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transfer，SCNT）胚胎表現(xiàn)出以DNA甲基化異常為主要表征的廣泛表觀遺傳突變?yōu)榉较�，發(fā)現(xiàn)DNA 5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）參與早期胚胎發(fā)育過程中的甲基化重編程。研究團(tuán)隊(duì)通過系統(tǒng)性地繪制了小鼠SCNT胚胎親本等位基因的特異性全基因組5hmC圖譜發(fā)現(xiàn)2細(xì)胞期供體體細(xì)胞的雙親本基因組短暫性獲得類似正常受精胚胎中父本基因組的對(duì)稱性羥甲基化模式，但整體信號(hào)明顯較弱且快速消退；尤其是在母本基因組克隆胚胎中，X染色體羥甲基化嚴(yán)重不足，而多個(gè)關(guān)鍵生殖印記控制區(qū)（germline imprinting control regions，gICRs）表現(xiàn)出較強(qiáng)去甲基化抵抗的模式。盡管新生5hmC生成與體細(xì)胞-受精卵轉(zhuǎn)換過程中的初始DNA去甲基化密切相關(guān)，但其與持續(xù)的甲基化變化隨后發(fā)生解耦。有趣的是，通過Tet3過表達(dá)提升全局5hmC水平會(huì)導(dǎo)致發(fā)育有關(guān)基因在2細(xì)胞期過早激活，從而導(dǎo)致SCNT胚胎發(fā)育失敗不良結(jié)局。這些發(fā)現(xiàn)通過揭示SCNT胚胎中異常5hmC重編程的獨(dú)特動(dòng)態(tài)及其功能結(jié)局，完善哺乳動(dòng)物克隆胚胎發(fā)育過程精準(zhǔn)的DNA羥甲基化調(diào)控的相關(guān)機(jī)制。
研究方法
胚胎模型構(gòu)建：以雜交小鼠（C57BL/6J × PWK/PhJ）的E13.5胎鼠成纖維細(xì)胞（MEFs）為核供體，構(gòu)建SCNT胚胎，并分階段（2細(xì)胞期、4-8細(xì)胞期、囊胚期）收集樣本。
多組學(xué)測(cè)序技術(shù)：
- ACE-seq：通過ACE-seq測(cè)序，單堿基分辨率檢測(cè)5hmC全基因組分布。
- WGBS：全基因組甲基化測(cè)序，與ACE-seq數(shù)據(jù)聯(lián)合分析5mC/5hmC動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)。
- RNA-seq：Smart-seq2技術(shù)分析基因表達(dá)，關(guān)聯(lián)5hmC修飾與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
功能驗(yàn)證：通過TET3過表達(dá)（mTet3-plus mRNA注射）提升5hmC水平，觀察其對(duì)發(fā)育的影響。
數(shù)據(jù)整合：整合WGBS和ACE-seq數(shù)據(jù)，精準(zhǔn)量化5mC/5hmC/未修飾胞嘧啶比例。
結(jié)果圖形
（1）SCNT胚胎發(fā)育過程中的5hmC全基因組圖譜
本研究首先構(gòu)建了SCNT胚胎從供體MEF至囊胚期發(fā)育過程中的完整5hmC動(dòng)態(tài)圖譜（圖1A）。通過整合WGBS與ACE-seq數(shù)據(jù)，研究者發(fā)現(xiàn)整體5hmC水平在2細(xì)胞期出現(xiàn)顯著峰值，隨后在4-8細(xì)胞期逐漸下降，至囊胚期達(dá)最低點(diǎn)，呈現(xiàn)"先升后降"的獨(dú)特動(dòng)態(tài)模式（圖1B-C）。具體而言，在體細(xì)胞-受精卵轉(zhuǎn)換（SZT）期間，高5hmC CpG位點(diǎn)比例及基因本體（gene body）區(qū)域的5hmC信號(hào)均顯著增強(qiáng)。值得注意的是，SCNT胚胎的DNA甲基化動(dòng)態(tài)表現(xiàn)為"去甲基化-de novo甲基化-二次去甲基化"的雙波模式，與5hmC的"單峰"模式形成鮮明對(duì)比（圖1C）。研究進(jìn)一步將78,732個(gè)差異羥甲基化區(qū)域（DhMR）分為四類：25,516個(gè)新生成5hmC位點(diǎn)、2,820個(gè)丟失5hmC位點(diǎn)、15,737個(gè)持續(xù)高5hmC位點(diǎn)及34,659個(gè)持續(xù)低5hmC位點(diǎn)（圖1D）�；蚪M特征分析顯示，新生成及穩(wěn)定高5hmC區(qū)域顯著富集于增強(qiáng)子、基因本體及H3K36me3/H3K27ac/H3K4me3修飾區(qū)域（圖1E-F），這表明5hmC沉積偏好轉(zhuǎn)錄活躍的調(diào)控元件。
圖1：SCNT胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞核5hmC的全基因組動(dòng)態(tài)圖譜
（2）5hmC參與SCNT胚胎第一次DNA去甲基化
研究深入探究了5hmC與5mC動(dòng)態(tài)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)5hmC與5mC在SZT轉(zhuǎn)換階段（MEF至2細(xì)胞期）存在特異性負(fù)相關(guān)（圖2D-E）。在2細(xì)胞期，發(fā)生去甲基化的DMRs伴隨顯著的5hmC生成，而維持高甲基化的區(qū)域則未見5hmC積累（圖2B-C）。值得注意的是，這種耦聯(lián)關(guān)系在后續(xù)發(fā)育階段（2細(xì)胞至4-8細(xì)胞期、4-8細(xì)胞至囊胚期）完全消失，5hmC水平在不同甲基化動(dòng)態(tài)區(qū)域間無差異。ACE-seq研究證實(shí)第一次去甲基化與5hmC生成緊密相關(guān)，而第二次去甲基化及de novo甲基化則不依賴于5hmC調(diào)控。
圖2：SCNT囊胚前DNA羥甲基化與DNA甲基化動(dòng)態(tài)的相關(guān)性
（3）SCNT胚胎生殖印記控制區(qū)的5hmC動(dòng)態(tài)
17個(gè)母本gICRs分析顯示，SCNT胚胎在2細(xì)胞至4-8細(xì)胞期維持高甲基化狀態(tài)，但在囊胚期第二次去甲基化中出現(xiàn)顯著5hmC非依賴性印記丟失（圖3A-B）。相關(guān)性分析驗(yàn)證結(jié)果揭示gICRs甲基化與5hmC水平在母本等位基因上無顯著關(guān)聯(lián)（圖3C-D），表明印記區(qū)域存在特殊的保護(hù)機(jī)制抵抗TET3介導(dǎo)的氧化。上述研究結(jié)果表明gICRs去甲基化機(jī)制不依賴于羥甲基化動(dòng)態(tài)變化。
圖3：母本gICR在SCNT發(fā)育過程中的5hmC水平變化。
（4）SCNT胚胎親本基因組X染色體的5hmC積累
X染色體劑量補(bǔ)償分析揭示了SCNT胚胎最顯著的性別特異性缺陷（圖4A）。在2細(xì)胞期，雌雄胚胎的常染色體5hmC水平在親本等位基因間對(duì)稱分布，但X染色體5hmC顯著低于常染色體；雌性胚胎的親本X染色體5hmC顯著低于常染色體和雄性胚胎的單一母本X染色體（圖4B）。該現(xiàn)象排除了MEF供體細(xì)胞的遺傳繼承（圖4E），證實(shí)是SZT重編程過程中5hmC生成不足所致。值得注意的是，SCNT胚胎Xist基因在雌性中顯著異常高表達(dá)（圖4C），但X染色體/常染色體轉(zhuǎn)錄比例在雌雄間無差異（圖4D），提示不足的5hmC可能通過維持高甲基化（圖4G）來促進(jìn)Xist異常激活，這可能破壞X染色體劑量補(bǔ)償機(jī)制。與野生型（WT）2細(xì)胞期胚胎相比，WT中X染色體5hmC水平與常染色體相當(dāng)（圖4F），揭示SCNT胚胎X染色體的"羥甲基化缺陷"具有克隆特異性。
圖4：雄雌胚胎及X染色體與常染色體之間的5hmC分布差異
（5）異常5hmC分布與SCNT發(fā)育障礙的相關(guān)性
比較SCNT與WT胚胎發(fā)現(xiàn)，盡管受精卵5hmC起始水平低于體細(xì)胞，WT在2細(xì)胞期胚胎5hmC總量仍顯著高于SCNT（圖5A），表明重編程效率不足。SCNT特異性高甲基化在4-8細(xì)胞期尤為突出（圖5A）。通過整合已發(fā)表WT胚胎數(shù)據(jù)，研究鑒定出四類DhMRs：SCNT特異區(qū)、WT特異區(qū)、共有高5hmC區(qū)和共有低5hmC區(qū)（圖5B）。其中，SCNT特異5hmC區(qū)域羥甲基化升高，且伴隨比WT更高的甲基化水平，提示"不完全重編程"狀態(tài)�；蚪M特征分析顯示，兩類細(xì)胞特異性DhMRs均富集于增強(qiáng)子（圖5C），且SCNT特異增強(qiáng)子關(guān)聯(lián)基因顯著下調(diào)，而WT特異增強(qiáng)子關(guān)聯(lián)基因富集于細(xì)胞命運(yùn)決定、模式形成等早期發(fā)育通路（圖5D-E）。
通過RNA測(cè)序Smart-seq2提供的高靈敏度轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與ACE-seq測(cè)序繪制的增強(qiáng)子5hmC信號(hào)圖譜進(jìn)行鄰近關(guān)聯(lián)分析，共鑒定出779個(gè)SCNT特異基因和1,047個(gè)WT特異基因。這種多組學(xué)聯(lián)用策略揭示，SCNT胚胎并非整體5hmC缺失，而是在關(guān)鍵發(fā)育增強(qiáng)子上"異位不足"，導(dǎo)致ZGA（合子基因組激活）相關(guān)發(fā)育程序未能正常啟動(dòng)，從而導(dǎo)致發(fā)育失敗。
圖5：2細(xì)胞期WT胚胎與SCNT胚胎5hmC分布比較
（6）SCNT胚胎親本等位基因特異性5hmC動(dòng)態(tài)
等位基因分辨率分析揭示了SCNT胚胎發(fā)育失敗的特異性模式（圖6A-B）。WT在2細(xì)胞期胚胎父本基因組5hmC達(dá)13.3%，母本僅2.69%，呈現(xiàn)典型不對(duì)稱分布；而SCNT的雌雄胚胎均表現(xiàn)為親本等位基因?qū)ΨQ（約4-5%）（圖6A）。在100 kb基因組范圍內(nèi)上，SCNT雙親本基因組的5hmC水平與彼此高度線性相關(guān)，且整體分布模式類似WT父本基因組但強(qiáng)度減弱（圖6C-D）。t-SNE降維分析顯示，SCNT 2細(xì)胞親本基因組聚類于WT父本基因組附近，而遠(yuǎn)離WT母本基因組（圖6E），表明無論DNA來源，卵胞質(zhì)促進(jìn)了"類精子"重編程。DNA甲基化分析顯示類似對(duì)稱性，且SCNT基因組從MEF到2細(xì)胞的甲基化水平和分布與WT精子到2細(xì)胞的父本基因組變化呈強(qiáng)線性相關(guān)，但去甲基化程度普遍更低。
圖6：SCNT胚胎與受精胚胎父本和母本基因組5hmC分布比較
（7）高5hmC破壞SCNT胚胎表觀遺傳譜
為驗(yàn)證5hmC功能，研究在SCNT胚胎中過表達(dá)mTet3-plus突變體（圖7A）。免疫熒光證實(shí)HA標(biāo)簽蛋白表達(dá)（圖7B），整體5hmC水平在2細(xì)胞期升至11.49%，遠(yuǎn)高于對(duì)照的4.13%（圖7C），且高5hmC CpG比例及親本等位基因信號(hào)均顯著增加。分析發(fā)現(xiàn)43,736個(gè)位點(diǎn)發(fā)生5hmC新生成，其中33,380個(gè)為"異位生成"（即在正常SCNT中不羥甲基化）（圖7D）。這些新生成位點(diǎn)強(qiáng)烈富集于增強(qiáng)子、H3K27me3/H3K36me3修飾區(qū)（圖7E）。去甲基化DMRs在過表達(dá)組中5hmC顯著升高（圖7F），驗(yàn)證了高5hmC與去甲基化正相關(guān)。然而，即使整體5hmC提升，親本基因組仍保持對(duì)稱性（圖7G），且雌性X染色體5hmC仍顯著低于常染色體（圖7H），說明X染色體抵抗不可單純通過TET3活性增強(qiáng)而克服。值得注意的是，過高5hmC并未改善SCNT胚胎發(fā)育，反而加劇阻滯，提示5hmC并非"越多越好"，其時(shí)空分布精確性至關(guān)重要。
圖7：Tet3過表達(dá)SCNT胚胎中5hmC的水平與分布
（8）異位5hmC生成導(dǎo)致基因過早激活并阻礙SCNT胚胎發(fā)育潛能
mTet3-plus過表達(dá)胚胎中，母本gICRs在2細(xì)胞期出現(xiàn)印記丟失（圖8A），而正常SCNT中此過程延遲至囊胚期，說明異位5hmC可突破印記保護(hù)。在SCNT中沉默/低表達(dá)且在過表達(dá)基因組中激活，且啟動(dòng)子區(qū)5hmC異位生成伴去甲基化的胚胎中鑒定出雌性597個(gè)、雄性753個(gè)異常再激活基因（圖8D）。GO分析顯示這些基因富集于"模式特化"、"區(qū)域化"、"成骨化"等原腸運(yùn)動(dòng)后事件（圖8E-F），表明2細(xì)胞期不應(yīng)表達(dá)的晚期發(fā)育基因被過早激活。發(fā)育追蹤顯示，無論100、200或500 ng/μL劑量，mTet3-plus過表達(dá)均顯著降低2細(xì)胞分裂率及囊胚形成率（圖8G）。研究最終證明，5hmC的"精準(zhǔn)調(diào)控"而非"整體提升"是SCNT成功的關(guān)鍵，異位羥甲基化會(huì)時(shí)序錯(cuò)亂地激活發(fā)育程序，導(dǎo)致胚胎在合子基因組激活（ZGA）階段即失去發(fā)育協(xié)調(diào)性。
圖8：SCNT胚胎中5hmC動(dòng)態(tài)與分布特征的示意圖
結(jié)論和啟示本研究通過創(chuàng)新的多組學(xué)技術(shù)整合，系統(tǒng)闡明了5hmC是小鼠SCNT胚胎重編程的關(guān)鍵表觀障礙，其異常表現(xiàn)為"時(shí)間錯(cuò)位、空間錯(cuò)誤、劑量失準(zhǔn)"。主要結(jié)論包括：
（1）SCNT胚胎在2細(xì)胞期建立了一種非生理的親本等位基因?qū)ΨQ5hmC分布，喪失自然受精中父本特異性高羥甲基化模式；
（2）雌性X染色體5hmC嚴(yán)重不足是導(dǎo)致劑量補(bǔ)償失敗的重要原因；
（3）印記區(qū)對(duì)5hmC介導(dǎo)的去甲基化具有抵抗性，但在囊胚期發(fā)生延遲性印記丟失；
（4）5hmC生成與第一次DNA去甲基化耦聯(lián)，但后續(xù)解耦，提示重編程存在一個(gè)關(guān)鍵時(shí)間窗口；
（5）全局提升5hmC水平反而導(dǎo)致發(fā)育基因過早激活和胚胎致死，證實(shí)精準(zhǔn)調(diào)控的必要性。
參考文獻(xiàn)：
Xiang Z, Yan R, Guo J, Wang M, Cheng X, Zhang F, Guo T, Long X, Guo F, Liang D. 5-Hydroxymethylcytosine Dynamics Reveals Coordinated Reprogramming of Parental Genomes and X Chromosome Dosage Balance in Mouse SCNT Embryos. Adv Sci (Weinh). 2025 Nov 18:e09682. doi: 10.1002/advs.202509682.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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