四種高通量亞細(xì)胞分辨率空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)平臺(tái)多維度全面測(cè)評(píng)

今天為大家分享的文章是發(fā)表于《Nature Communications》的《Systematic benchmarking of high-throughput subcellular spatial transcriptomics platforms across human tumors》。該研究針對(duì)空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)快速發(fā)展但缺乏系統(tǒng)基準(zhǔn)測(cè)試的現(xiàn)狀，在統(tǒng)一實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)四種高通量亞細(xì)胞分辨率空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)平臺(tái)（Stereo-seq v1.3、Visium HD FFPE、CosMx 6K、Xenium 5K）進(jìn)行了全面評(píng)估。研究采用結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、卵巢癌三種癌癥的未治療臨床樣本，通過(guò) FFPE、新鮮冷凍、單細(xì)胞懸液等多種處理方式，結(jié)合 CODEX 蛋白圖譜和 scRNA-seq 作為參考數(shù)據(jù)，從分子捕獲效率、背景噪聲控制、單細(xì)胞分割、細(xì)胞注釋、空間聚類等多維度開展測(cè)試。

研究思路思維導(dǎo)圖

下面我們來(lái)看一下文章中的具體結(jié)果：

一、分子捕獲效率評(píng)估
1：標(biāo)記基因檢測(cè)靈敏度：上皮細(xì)胞標(biāo)記基因 EPCAM 在所有平臺(tái)均呈現(xiàn)清晰空間模式，與 H&E 染色和 PanCK 免疫染色一致；Xenium 5K 對(duì) EPCAM、CD68、CD4 等多種標(biāo)記基因的檢測(cè)靈敏度最優(yōu)（平均轉(zhuǎn)錄本計(jì)數(shù)更高）；在共享區(qū)域和 ROI（400×400μm）分析中，Visium HD FFPE 的癌癥細(xì)胞標(biāo)記基因檢測(cè)優(yōu)于 Stereo-seq v1.3，Xenium 5K 優(yōu)于 CosMx 6K。

2：與 scRNA-seq 的相關(guān)性：Stereo-seq v1.3（R=0.85）、Visium HD FFPE（R=0.80）、Xenium 5K（R=0.82）與 scRNA-seq 的基因表達(dá)相關(guān)性高，而 CosMx 6K（R=0.53）比較大。

3：轉(zhuǎn)錄本 / 基因檢出量：
單基因轉(zhuǎn)錄本計(jì)數(shù)：Stereo-seq v1.3、Visium HD FFPE、Xenium 5K 的基因表達(dá)變異性強(qiáng)，能有效檢測(cè)不同表達(dá)水平基因；CosMx 6K 雖總轉(zhuǎn)錄本計(jì)數(shù)更高，但基因間變異性低，難以區(qū)分差異表達(dá)。

4：每 8μm bin 檢出量：Visium HD FFPE 的轉(zhuǎn)錄本和基因檢出量?jī)?yōu)于 Stereo-seq v1.3；Xenium 5K 在 HCC 中檢出量高于 CosMx 6K，在 OV 中因癌癥類型和基因面板差異略低，共享基因分析中 Xenium 5K 仍更優(yōu)。

5：測(cè)序質(zhì)量：Stereo-seq v1.3 的 UMI 質(zhì)控通過(guò)率高，但無(wú)效空間條形碼比例高（空間信息丟失多），且基因組間區(qū)域映射比例高；Visium HD FFPE 在相同測(cè)序深度下，人類轉(zhuǎn)錄本測(cè)序飽和度更低。

圖1：跨ST平臺(tái)的基因檢測(cè)靈敏度評(píng)估

二：背景噪聲與擴(kuò)散控制評(píng)估
1.背景噪聲控制：iST 平臺(tái)中，CosMx 6K 的陰性探針（NegProbe）和陰性代碼（NegCode）信號(hào)顯著高于 Xenium 5K，且陰性信號(hào)的空間自相關(guān)性（Moran’s I）更強(qiáng)（聚集性高，背景干擾大）；歸一化后，Xenium 5K 的陰性控制信號(hào)占比更低，在 OV 樣本壞死區(qū)域的背景噪聲尤為微弱；非特異性探針結(jié)合是 iST 平臺(tái)背景噪聲的主要來(lái)源（陰性探針信號(hào) > 陰性代碼）。

2.轉(zhuǎn)錄本擴(kuò)散控制：sST 平臺(tái)中，Stereo-seq v1.3 和 Visium HD FFPE 均存在組織邊界外的轉(zhuǎn)錄本擴(kuò)散，但 Visium HD FFPE 的擴(kuò)散距離更短、組織外轉(zhuǎn)錄本豐度更低；歸一化后（組織外 / 組織內(nèi)轉(zhuǎn)錄本計(jì)數(shù)比），Stereo-seq v1.3 的擴(kuò)散程度顯著高于 Visium HD FFPE。

圖2：背景噪聲與擴(kuò)散控制評(píng)估

三、轉(zhuǎn)錄本定位準(zhǔn)確性評(píng)估
1.局部空間一致性：在 COAD 的三級(jí)淋巴樣結(jié)構(gòu)（TLS）區(qū)域，Visium HD FFPE 和 Xenium 5K 的 B 細(xì)胞（MS4A1）、CD4+T 細(xì)胞（CD4）、CD8+T 細(xì)胞（CD8A）標(biāo)記基因空間分布與 CODEX 蛋白染色（CD20、CD4、CD8）高度吻合；在 HCC 血管區(qū)域，Xenium 5K 的 CD34（內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記）轉(zhuǎn)錄本沿血管邊緣富集，與解剖結(jié)構(gòu)一致；在 OV 巨噬細(xì)胞富集區(qū)域，所有平臺(tái)均能檢測(cè)到 CD68 表達(dá)。

2：全局一致性：基于 CODEX 注釋的細(xì)胞類型，Visium HD FFPE（sST 中）和 Xenium 5K（iST 中）與 CODEX 的空間模式相關(guān)性更高；上皮細(xì)胞（COAD/OV 中高豐度）的平臺(tái)間差異較小，免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的差異更顯著。

3：特征基因集一致性：利用 scRNA-seq 鑒定的細(xì)胞類型差異表達(dá)基因構(gòu)建特征集，其空間一致性優(yōu)于單個(gè)標(biāo)記基因；Visium HD FFPE 和 Xenium 5K 的特征集與 CODEX 的相關(guān)性仍為最優(yōu)。

 圖3：轉(zhuǎn)錄本與蛋白質(zhì)相關(guān)性的評(píng)估

四、單細(xì)胞分割評(píng)估
1.分割形態(tài)學(xué)差異：CosMx 6K 和 Xenium 5K 基于核 / 膜 / 細(xì)胞質(zhì)多通道染色進(jìn)行分割，Stereo-seq v1.3 通過(guò)核掩碼擴(kuò)展 5μm 估算細(xì)胞邊界（Visium HD FFPE 無(wú)官方分割算法）；CosMx 6K 分割的細(xì)胞更大、凸度（solidity）和圓度更高（形態(tài)更規(guī)則），Xenium 5K 能有效捕獲肝細(xì)胞等不規(guī)則形態(tài)細(xì)胞。

2.分割準(zhǔn)確性：以 72,405 個(gè)手動(dòng)標(biāo)注核邊界為金標(biāo)準(zhǔn)，Xenium 5K 和 CosMx 6K 的自動(dòng)分割細(xì)胞數(shù)量與手動(dòng)計(jì)數(shù)匹配度高（偏差小）；Stereo-seq v1.3 因染色偽影，常將非細(xì)胞結(jié)構(gòu)誤判為細(xì)胞，分割數(shù)量偏差大（自動(dòng)計(jì)數(shù) > 手動(dòng)計(jì)數(shù)）。

3.轉(zhuǎn)錄本分配效率：Xenium 5K 和 CosMx 6K 能將更高比例的轉(zhuǎn)錄本保留在細(xì)胞邊界內(nèi)；在共享基因集中，iST 平臺(tái)（Xenium 5K/CosMx 6K）的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本 / 基因計(jì)數(shù)與 scRNA-seq 相當(dāng)；Xenium 5K 的核分割結(jié)果中，基因和轉(zhuǎn)錄本計(jì)數(shù)更高。

4.人工共表達(dá)控制：ST 數(shù)據(jù)中 EPCAM（上皮）與 CD3E/CD68（免疫）的共表達(dá)水平高于 scRNA-seq；Xenium 5K 分割后，36 對(duì)互斥譜系標(biāo)記基因的共表達(dá)相關(guān)性最低（分離效果最優(yōu)），Stereo-seq v1.3 最差。

其中CosMx 6K分割細(xì)胞形態(tài)更規(guī)則（更大、凸度和圓度更高），轉(zhuǎn)錄本保留在細(xì)胞邊界內(nèi)的比例高，與 Xenium 5K 同為 iST 平臺(tái)，在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本分配效率上遠(yuǎn)超 sST 平臺(tái)。

圖4：細(xì)胞分割的比較

五、細(xì)胞聚類與注釋評(píng)估
1．聚類效果：scRNA-seq 的聚類分離度（平均輪廓寬度 ASW）最高；ST 平臺(tái)中，iST 平臺(tái)（Xenium 5K/CosMx 6K）因亞細(xì)胞分辨率，聚類分離度優(yōu)于 sST 平臺(tái)（Stereo-seq v1.3/Visium HD FFPE），能更清晰區(qū)分細(xì)胞亞型。

2.細(xì)胞類型注釋可靠性：
注釋一致性：Xenium 5K 在 5 種注釋工具（SELINA/Celltypist 等）中的細(xì)胞類型注釋一致性最高（多工具標(biāo)注相同類型的細(xì)胞比例高），熵值低（注釋穩(wěn)定性強(qiáng)）；CosMx 6K 能恢復(fù)更多細(xì)胞類型。

與 scRNA-seq 匹配度：Xenium 5K 的標(biāo)記基因（CD34/COL5A2/CD68 等）表達(dá)模式與 scRNA-seq 最吻合；Stereo-seq v1.3 在 COAD/OV 中與 scRNA-seq 一致性高，Xenium 5K 在 HCC/OV 中最優(yōu)。

亞型注釋：Xenium 5K 和 CosMx 6K 能恢復(fù)更多 T 細(xì)胞亞型. 在結(jié)直腸癌的三級(jí)淋巴樣結(jié)構(gòu)中，CosMx 6K 能同時(shí)捕獲 B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞及血漿細(xì)胞等多種免疫亞型，為免疫微環(huán)境的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析提供了完整數(shù)據(jù)。

3.多通道染色優(yōu)勢(shì)：Xenium 5K 的核 / 膜 / 細(xì)胞質(zhì)多通道染色能準(zhǔn)確捕獲肝細(xì)胞等不規(guī)則形態(tài)，提升轉(zhuǎn)錄本分配準(zhǔn)確性，還能識(shí)別多核細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、肝細(xì)胞），而核僅分割方法難以實(shí)現(xiàn)。

圖5：細(xì)胞聚類、細(xì)胞類型注釋以及與相鄰CODEX的空間對(duì)齊的比較分析

六、空間聚類與通路富集評(píng)估
1.空間聚類一致性：使用 CellCharter 進(jìn)行空間聚類，除 HCC 中的 Stereo-seq v1.3 外，其余平臺(tái)與 CODEX 的聚類比例相關(guān)性均較高（大尺度組織架構(gòu)還原效果好）；所有平臺(tái)均能識(shí)別腫瘤核心與邊界區(qū)域的惡性細(xì)胞分布，Visium HD FFPE 和 Xenium 5K 能勾勒更連續(xù)的腫瘤邊界；Xenium 5K 還能區(qū)分腫瘤浸潤(rùn)型與外周型 CD8+T 細(xì)胞。

2.差異基因與通路富集：
差異表達(dá)基因（DEG）：Xenium 5K 在免疫浸潤(rùn)區(qū) vs 腫瘤區(qū)、腫瘤區(qū) vs 正常上皮區(qū)的 DEG 數(shù)量和比例最高，CosMx 6K 最少；平臺(tái)間 DEG 存在重疊，但平臺(tái)特異性 DEG 較多（反映檢測(cè)靈敏度差異）。

通路富集：Xenium 5K 在免疫浸潤(rùn)區(qū)優(yōu)先富集 T 細(xì)胞激活、白細(xì)胞細(xì)胞毒性等免疫相關(guān)通路，在腫瘤區(qū)富集細(xì)胞分裂 / 增殖通路；Visium HD FFPE 腫瘤區(qū)富集類似增殖通路，但免疫區(qū)通路偏向細(xì)胞外基質(zhì)組織；CosMx 6K 腫瘤區(qū)富集代謝相關(guān)通路。

圖6：空間聚類與惡性細(xì)胞分布的比較

綜合以上，我們可以看到CosMx 6K具有總捕獲量高；樣本兼容性高；單細(xì)胞分割形態(tài)規(guī)則，轉(zhuǎn)錄本分配準(zhǔn)，多核細(xì)胞可識(shí)別；亞型覆蓋細(xì)胞類型 / 亞型捕獲全，稀有亞型可檢出；空間架構(gòu)區(qū)域邊界清晰等核心優(yōu)勢(shì)，契合具有以下需求的研究人員：
1、聚焦細(xì)胞亞型廣譜捕獲（如免疫細(xì)胞細(xì)分亞群），需完整呈現(xiàn)細(xì)胞類型多樣性的研究
2、利用臨床FFPE 存檔樣本，開展腫瘤微環(huán)境、疾病進(jìn)展相關(guān)的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究
3、需快速獲得大量轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)，進(jìn)行初步篩查后再深入分析的研究（如藥物靶點(diǎn)初步篩選）

樂(lè)備實(shí)是國(guó)內(nèi)專注于提供高質(zhì)量蛋白檢測(cè)以及組學(xué)分析服務(wù)的實(shí)驗(yàn)服務(wù)專家，自2018年成立以來(lái)，樂(lè)備實(shí)不斷尋求突破，公司的服務(wù)技術(shù)平臺(tái)已擴(kuò)展到單細(xì)胞測(cè)序、空間多組學(xué)、流式檢測(cè)、超敏電化學(xué)發(fā)光、Luminex多因子檢測(cè)、抗體芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫組化、DSP空間多組學(xué)等30多個(gè)，建立起了一套涵蓋基因、蛋白、細(xì)胞以及組織水平實(shí)驗(yàn)的完整檢測(cè)體系。