氫氘交換質(zhì)譜（HDX-MS）推進(jìn)酶定向進(jìn)化/揭示酶隧道動(dòng)力學(xué)

▶ 發(fā)表時(shí)間：2025年11月21日

▶ 期刊：ACS Catalysis (IF 13.1)

▶ 發(fā)表團(tuán)隊(duì)：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院

▶ 文章標(biāo)題：ESTEEM Strategy: Revolutionizing Enzymatic Catalysis through the Evolutionary Gateway of Enzyme Tunnels

▶ 核心內(nèi)容：

在理性蛋白設(shè)計(jì)領(lǐng)域，如何將進(jìn)化信息與動(dòng)態(tài)構(gòu)象分析相結(jié)合，是突破酶工程瓶頸的關(guān)鍵。近日，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院的團(tuán)隊(duì)發(fā)表于《ACS Catalysis》的研究提出了名為ESTEEM的創(chuàng)新策略，并借助氫氘交換質(zhì)譜（HDX-MS） 這一關(guān)鍵技術(shù)，首次從實(shí)驗(yàn)層面直接揭示了底物隧道構(gòu)象動(dòng)力學(xué)在催化效率提升中的核心作用，為高效生物催化劑的設(shè)計(jì)提供了全新范式。

研究背景：從靜態(tài)結(jié)構(gòu)到動(dòng)態(tài)機(jī)制的認(rèn)知跨越
酶催化效率的優(yōu)化是合成生物學(xué)與工業(yè)生物催化領(lǐng)域的核心挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的理性設(shè)計(jì)多聚焦于酶的活性中心或靜態(tài)結(jié)構(gòu)，而對(duì)遠(yuǎn)離活性中心的調(diào)控區(qū)域，尤其是動(dòng)態(tài)的底物傳輸隧道，缺乏有效的預(yù)測(cè)與工程化手段。

盡管計(jì)算模擬能夠預(yù)測(cè)隧道幾何形狀的變化，但這些預(yù)測(cè)亟需在原子分辨率下、在溶液環(huán)境中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。ESTEEM（Evolutionary-Structural Tuning of Enzyme Efficiency Modules）策略的提出，正是為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)。該策略通過(guò)整合進(jìn)化保守性分析與三維結(jié)構(gòu)特征，精準(zhǔn)定位對(duì)酶功能具有潛在調(diào)控能力的非保守殘基。

圖1. ESTEEM策略之篩選促酶活突變位點(diǎn)

ESTEEM策略的成功驗(yàn)證與性能飛躍

本研究以細(xì)胞色素P450單加氧酶CYP107Hb.am為模型。通過(guò)ESTEEM策略，研究團(tuán)隊(duì)篩選出位于底物隧道瓶頸區(qū)的兩個(gè)非保守殘基Ile67和Gln83, 經(jīng)兩輪迭代飽和突變，獲得雙突變體CYP107Hb.amI67DQ83H。 該變體展現(xiàn)出令人矚目的催化性能提升：總周轉(zhuǎn)數(shù)（TTN）提升106倍，催化效率提升82倍，耦合效率從0.6%大幅提升至69.85%，熱穩(wěn)定性同步提高。

圖2. CYP107Hb.am的突變位點(diǎn)篩選圖示（上圖A/B）與各個(gè)氨基酸位點(diǎn)打分結(jié)果（下圖A/B)

HDX-MS：從性能提升到機(jī)制解析的關(guān)鍵橋梁

性能的提升需要機(jī)制的闡明。研究團(tuán)隊(duì)采用了一系列手段，其中氫氘交換質(zhì)譜（HDX-MS）在揭示變體動(dòng)態(tài)構(gòu)象變化方面發(fā)揮了不可替代的作用。

1. 技術(shù)原理

HDX-MS通過(guò)測(cè)量蛋白質(zhì)主鏈酰胺氫與氘代溶劑中氘的交換速率，來(lái)定量分析蛋白質(zhì)不同區(qū)域的構(gòu)象動(dòng)態(tài)性與溶劑可及性。氘?dāng)z取率的降低表明該區(qū)域結(jié)構(gòu)剛性增強(qiáng)或溶劑可及性降低；反之，則表明柔性增加。

2. 核心發(fā)現(xiàn)

通過(guò)對(duì)野生型及雙突變體進(jìn)行HDX-MS分析(圖3)，研究獲得了以下關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：

I67D突變誘導(dǎo)剛性化：位于B-B’環(huán)的I67D突變導(dǎo)致該區(qū)域肽段的氘?dāng)z取率顯著降低（從~24%降至12%），表明該突變穩(wěn)定了隧道瓶頸區(qū)的局部構(gòu)象，減少了無(wú)效波動(dòng)(圖3A, 3C)。

Q83H突變引入局部柔性：與之相對(duì)，B’螺旋上的Q83H突變則使其所在肽段的氘?dāng)z取率升高（從~12%增至19%），提示該區(qū)域動(dòng)態(tài)性增強(qiáng)(圖3A, 3C)。

協(xié)同效應(yīng)與遠(yuǎn)程調(diào)控：雙突變體呈現(xiàn)出一種“剛?cè)岵��?jì)”的協(xié)同動(dòng)態(tài)模式：B-B’環(huán)與F-G loop的剛性增強(qiáng)，而B(niǎo)’ helix的適度柔性化，共同優(yōu)化了隧道的整體構(gòu)象。相關(guān)性分析進(jìn)一步顯示，這些關(guān)鍵區(qū)域的運(yùn)動(dòng)模式從互不相關(guān)轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨葏f(xié)同 (圖3D)。

圖3. HDX-MS技術(shù)闡明CYP107Hb.am突變體關(guān)鍵區(qū)域的結(jié)構(gòu)剛?cè)嶙兓?/p>
整合機(jī)制模型：隧道動(dòng)力學(xué)的精準(zhǔn)調(diào)控

結(jié)合自適應(yīng)導(dǎo)向分子動(dòng)力學(xué)（ASMD）模擬與HDX-MS實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，研究提出了一個(gè)令人信服的機(jī)制模型：ESTEEM策略所篩選的隧道殘基突變，并非簡(jiǎn)單地?cái)U(kuò)大隧道尺寸，而是通過(guò)重新平衡隧道關(guān)鍵區(qū)域的剛性-柔性關(guān)系，塑造了一個(gè)幾何結(jié)構(gòu)更優(yōu)、動(dòng)態(tài)更穩(wěn)定的底物傳輸路徑。這種“動(dòng)態(tài)變構(gòu)”效應(yīng)降低了產(chǎn)物解離過(guò)程中的自由能壘 (圖4C，PMF降低近20 kcal/mol)，從而極大地提升了催化周轉(zhuǎn)速率。ASMD模擬直觀地展示了產(chǎn)物沿此優(yōu)化路徑的排出過(guò)程 (圖4B)。

圖4. CYP107Hb.am突變體的平均力勢(shì)能PMF降低

這項(xiàng)工作標(biāo)志著酶工程正從對(duì)靜態(tài)結(jié)構(gòu)的依賴，邁向?qū)?strong>動(dòng)態(tài)構(gòu)象進(jìn)行理性設(shè)計(jì)的新階段。同時(shí)，HDX-MS技術(shù)有望在該領(lǐng)域發(fā)揮更多、更廣泛的應(yīng)用，解密酶改造后的結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化，為酶工程設(shè)計(jì)提供基于蛋白結(jié)構(gòu)方面的實(shí)驗(yàn)論據(jù)。