人多能干細(xì)胞(hPSC)誘導(dǎo)心臟類器官培養(yǎng)攻略

人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法

一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基配制
（1）2-8℃解凍 hPSC Medium Supplement，融化后上下晃動(dòng)混勻，按實(shí)際用量進(jìn)行分裝，立即使用或儲(chǔ)存于-20 - 80℃，避免反復(fù)凍融；
（2）按 1:50 的比例將 hPSC Medium Supplement（10mL）加入到 hPSC Medium Basal Medium(500mL)中，混合均勻即成為人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基（abs9403）。
注意：混勻后的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基可在 2-8℃ 穩(wěn)定儲(chǔ)存 2-3 周，不建議使用配制已超過 3 周的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基。
（3） 實(shí)驗(yàn)試劑平衡：人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)前放置室溫避光平衡；PBS，消化液等 37℃加熱。
注意：培養(yǎng)基中含有因子，不要 37℃水浴加熱。

二、操作方法(以下步驟皆應(yīng)在無菌條件下操作)

hPSC 細(xì)胞復(fù)蘇：
1、實(shí)驗(yàn)操作步驟：
1.1、基質(zhì)膠包被培養(yǎng)板：取出 6 孔板/12 孔板，每孔內(nèi)加入 1 mL/0.5 mL 即用型基質(zhì)膠（abs9410），輕輕晃動(dòng) 6 孔板/12 孔板使基質(zhì)膠完全覆蓋皿底，置于 37℃培養(yǎng)箱中孵育 1h~2h，實(shí)驗(yàn)前拿出并置于超凈工作臺/生物安全柜中室溫下平衡 20min。如果暫時(shí)不用，可用 Parafilm 封口后 2-8℃ 儲(chǔ)存，并于 1 周內(nèi)使用。

注意：
①一支凍存的干細(xì)胞的數(shù)量在 1×10 6cells/mL 左右，對應(yīng) 6 孔板 1 孔；
②即用型基質(zhì)膠對溫度敏感，即用即拿，用完后立即放回 4℃冰箱保存，且勿用手直接觸碰基質(zhì)膠液面所及的瓶身，影響基質(zhì)膠質(zhì)量。

1.2、先將 2~3mL 的干細(xì)胞培養(yǎng)基加入 15mL 離心管中備用。

1.3、解凍：將從液氮中取出的凍存管快速浸入 37℃溫水中，快速搖動(dòng)，使其在 1~2min 內(nèi)快速解凍；
注意：細(xì)胞從液氮中拿出的速度要快，盡量減少其暴露在室溫中的時(shí)間。

1.4、離心：凍存管中的凍存液解凍后，將其逐滴加入含有干細(xì)胞培養(yǎng)基的 15mL 離心管中，將 15mL 離心管置于低速離心機(jī)中配比平衡后，1000rpm 離心 3min；

1.5、重懸：離心后棄上清加 1mL 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基對干細(xì)胞沉淀進(jìn)行吹吸混勻，吹吸 3~5 次左右。

1.6、接種：吹吸均勻后，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠棄掉，將吹打均勻的干細(xì)胞懸液加入到已經(jīng)包被好的 6 孔 板中，并補(bǔ)全每孔 2mL 培養(yǎng)體系。

1.7、培養(yǎng)：接種后的 6 孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細(xì)胞密度以及細(xì)胞團(tuán)塊大小，呈 4 個(gè)細(xì)胞以上的團(tuán)塊較合格，水平十字輕輕晃動(dòng) 6 孔板/12 孔板使細(xì)胞均勻分布。并置于 37℃，5%CO₂的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 第 2 天觀察細(xì)胞貼壁情況；

1.8、換液：從復(fù)蘇的時(shí)間開始每 24h 換液一次。
注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每 24h 應(yīng)及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基。

hPSC 細(xì)胞傳代：
2、實(shí)驗(yàn)具體操作步驟：
2.1、清洗：吸掉原有培養(yǎng)基，貼壁緩慢加入 1 mL PBS 緩沖液并輕輕晃動(dòng)，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去 PBS 緩沖液；

2.2、消化：在 6 孔板中加入 2mL/孔人多能干細(xì)胞消化液（abs9409）使之覆蓋皿底，并置于 37℃培養(yǎng)箱中 2~5 min；

注意：消化時(shí)間依據(jù)干細(xì)胞生長密度，消化時(shí)間略有不同，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)一般建議時(shí)間 2-5min。消化過程中可以拿到倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內(nèi)部細(xì)胞間出現(xiàn)間隙，即可吸掉消化液終止消化。

2.3、吹打：吸掉消化液后，加入 2mL 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打培養(yǎng)皿底，輕柔吹打 3~5 次，使皿底干細(xì)胞集落脫落，并將其并轉(zhuǎn)移到 15mL 離心管中；
注意：吹吸皿底細(xì)胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)在 3~5 次為宜，盡量避免形成單細(xì)胞。如有少量細(xì)胞無法從皿底脫落，屬于正常現(xiàn)象。如有大量細(xì)胞無法從皿底脫落，需延長消化時(shí)間。

2.4、離心：1000rpm 離心 3min，棄上清；

2.5、接種：用干細(xì)胞培養(yǎng)基吹打細(xì)胞 5-10 次，吸掉包被培養(yǎng)板中的基質(zhì)膠，并將細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)板中，且補(bǔ)全每孔 2mL 的培養(yǎng)體系。
注意：吹打細(xì)胞要溫柔，并且吹打次數(shù)不要超過 10 次。

2.6、換液：從傳代的時(shí)間開始每 24h 換液一次。
注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每 24h 應(yīng)及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基。

hPSC 細(xì)胞凍存
3、實(shí)驗(yàn)具體操作步驟：
3.1、清洗：同 2.1；
3.2、消化：同 2.2；
3.3、吹打：同 2.3；
3.4、離心：同 2.4；
3.5、重懸：離心后棄上清，加入 2 mL ES/iPS 細(xì)胞凍存液（abs9412）對干細(xì)胞沉淀進(jìn)行吹吸混勻，吹吸 3~5 次后，將其加入到凍存管中；
注意：凍存液即用即拿，及時(shí)放回 4℃冰箱。

3.6、記錄：在凍存管上標(biāo)記凍存細(xì)胞種類、時(shí)間、操作者及細(xì)胞批次。

3.7、-80℃冰箱凍存：凍存管置于-80℃冰箱過夜。
注意：凍存管放置于-80℃冰箱時(shí)，要將凍存管直立放置，切忌凍存管斜放或橫放。

3.8、液氮凍存：24 小時(shí)后將-80℃冰箱中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮中長期凍存。

多能干誘導(dǎo)心臟類器官

一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、hPSC誘導(dǎo)分化心臟類器官試劑盒（abs90364-1kit）

產(chǎn)品組成：

研究階段	名稱	規(guī)格	儲(chǔ)存條件及周期
Ⅰ階段（D0-2）	基礎(chǔ)培養(yǎng)基1 + 補(bǔ)充劑A	9.98mL + 20μL	-20℃，12個(gè)月 / 6個(gè)月
Ⅱ階段（D3-4）	基礎(chǔ)培養(yǎng)基2 + 補(bǔ)充劑B	9.94mL + 60μL	-20℃，12個(gè)月 / 6個(gè)月
Ⅲ階段（D5-6）	基礎(chǔ)培養(yǎng)基3 + 補(bǔ)充劑C	9.98mL + 20μL	-20℃，6個(gè)月
Ⅳ階段（D7-20）	成熟培養(yǎng)基	200mL	-20℃，12個(gè)月

2、輔助試劑

序號	品名	貨號	規(guī)格	儲(chǔ)存條件及周期
1	H9人胚胎干細(xì)胞（無飼養(yǎng)層）	abs90248	1mL	液氮儲(chǔ)存
2	人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基Plus	abs9403	500mL	基礎(chǔ)培養(yǎng)基：2-8℃，18個(gè)月；添加劑：-20℃，18個(gè)月
3	人多能干細(xì)胞消化液	abs9409	100mL	-20℃，2年
4	ES/iPS細(xì)胞凍存液	abs9412	100mL	-20℃，1年，冰袋運(yùn)輸
5	即用型基質(zhì)膠	abs9410	100mL	2-8℃保存，有效期6個(gè)月。
6	PBS	abs962	500mL	2~8℃或室溫，12個(gè)月

  
3、實(shí)驗(yàn)耗材

序號	品名	貨號	規(guī)格	儲(chǔ)存條件及周期
1	細(xì)胞培養(yǎng)板(標(biāo)準(zhǔn)透明6孔板)	abs7033	1箱	室溫，保質(zhì)期3年
2	超低吸附培養(yǎng)板（96孔圓底板）	abs7060	1箱	室溫，保質(zhì)期3年
3	10mL一次性移液管	abs7053	1箱	室溫，保質(zhì)期3年
4	25mL一次性移液管	abs7054	1箱	室溫，保質(zhì)期3年
5	2mL內(nèi)旋凍存管	abs7164	1箱	室溫，保質(zhì)期3年
6	2mL低溫金屬冰盒(24孔,平底)	abs7289	1個(gè)	室溫

二、誘導(dǎo)流程圖

D0-D3：hiPSC形成EB（擬胚體）
D3-D5：EB開始擴(kuò)大
D5-D7：特化EB誘導(dǎo)
D7：EB分化為心臟類器官
D12：出現(xiàn)早期搏動(dòng)
D20：心臟類器官成熟

三、實(shí)驗(yàn)方法
1、Ⅰ階段（D0-2）（按1個(gè)96孔板，每孔100uL算）
（1）hPSC于基質(zhì)膠包被的六孔板的一個(gè)孔生長至70-80%匯合度。
（2）吸去培養(yǎng)基。
（3）孔中加入1mLPBS（無鈣鎂離子）洗，吸去。
（4）孔中加入1mLAccutase，37℃消化3min。
（5）消化完成后于顯微鏡下可看到克隆發(fā)白發(fā)亮。輕拍孔板側(cè)邊幾下，使細(xì)胞脫離板底，加入1mL人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基Plus終止消化，并使用P-1000吸頭將這2mL細(xì)胞單懸液收集到15mL 離心管中，室溫下300g離心5min。
（6）離心結(jié)束，去除上清至剩20ul，輕彈管底3-4下，將1mL預(yù)熱的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基Plus（含10μMY-27632）重懸細(xì)胞，輕輕地上下移液以確保單細(xì)胞溶液均勻。
（7）使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，使用臺盼藍(lán)排除死亡細(xì)胞 ，按每孔5000個(gè)細(xì)胞的比例將所需細(xì)胞收集到離心管中，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基1與補(bǔ)充劑A充分混合，將上面1mL細(xì)胞懸液加入9mL的含補(bǔ)充劑A的基礎(chǔ)培養(yǎng)基1中，將細(xì)胞吹打均勻，然后按每孔100uL的體積將細(xì)胞懸液接種到超低96孔板中，1000rpm離心5min，然后將孔板轉(zhuǎn)移到37℃、5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3天。使用低吸附96孔板，可誘導(dǎo)2板192個(gè)心臟類器官，成功率70-80%。

2、Ⅱ階段（D3-4）
第3天，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基2與補(bǔ)充劑B充分混勻，配置成Ⅱ階段培養(yǎng)基，從孔中抽吸培養(yǎng)基，按每孔100uL的體積將Ⅱ階段培養(yǎng)基加入孔中，將培養(yǎng)板放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)2天。

3、Ⅲ階段（D5-6）
第5天，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基3與補(bǔ)充劑C充分混勻，配置成Ⅲ階段培養(yǎng)基，從孔中抽吸培養(yǎng)基，按每孔100uL的體積將Ⅲ階段培養(yǎng)基加入孔中，將培養(yǎng)板放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)2天。

4、Ⅳ階段（D7-21）
（1）第7天，從孔中抽吸培養(yǎng)基，按每孔100uL的體積將基礎(chǔ)培養(yǎng)基4加入孔中，將培養(yǎng)板放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，開始長期培養(yǎng)，每2天換一次培養(yǎng)基。
（2）心臟類器官將在分化后的10-13天開始跳動(dòng)，進(jìn)一步培養(yǎng)后第19-21天取樣鑒定。

所需產(chǎn)品清單

貨號	品名	規(guī)格	儲(chǔ)存條件及周期
abs90364	hPSC誘導(dǎo)分化心臟類器官試劑盒	1 kit	-20℃，有效期6個(gè)月；基礎(chǔ)培養(yǎng)基：2-8℃，18個(gè)月
abs9495	基質(zhì)膠(低因子,無酚紅)	1.5mL×4	保存-80°C冰箱，有效期 2 年。
abs90248	H9人胚胎干細(xì)胞（無飼養(yǎng)層）	1mL	液氮儲(chǔ)存
abs9403	人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基Plus	500mL	基礎(chǔ)培養(yǎng)基：2-8℃，18個(gè)月；添加劑：-20℃，18個(gè)月
abs9409	人多能干細(xì)胞消化液	100mL	-20℃，2年
abs9412	ES/iPS細(xì)胞凍存液	100mL	-20℃，1年，冰袋運(yùn)輸
abs9410	即用型基質(zhì)膠	100mL	2-8℃保存，有效期6個(gè)月。
abs962	PBS	500mL	2~8℃或室溫，12個(gè)月
abs7033	細(xì)胞培養(yǎng)板(標(biāo)準(zhǔn)透明6孔板)	1箱	室溫，保質(zhì)期3年
abs7060	超低吸附培養(yǎng)板（96孔圓底板）	1箱	室溫，保質(zhì)期3年
abs7053	10mL一次性移液管	1箱	室溫，保質(zhì)期3年
abs7054	25mL一次性移液管	1箱	室溫，保質(zhì)期3年
abs7164	2mL內(nèi)旋凍存管	1箱	室溫，保質(zhì)期3年
abs7289	2mL低溫金屬冰盒(24孔,平底)	1個(gè)	室溫