RNA甲基化綜述：RNA修飾的生理和病理功能及其潛在臨床應(yīng)用

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2023年09月15日，來(lái)自德國(guó)癌癥研究中心(Deutsches Krebsforschungszentrum，DKFZ) 的Michaela Frye團(tuán)隊(duì)在《Nature Reviews Genetics》（IF52/Q1）期刊發(fā)表題為“RNA modifications in physiology anddisease: towards clinical applications”的重磅綜述，系統(tǒng)闡述了RNA修飾在生理功能、疾病機(jī)制及臨床應(yīng)用中的最新進(jìn)展。首先，文章綜合介紹了mRNA、tRNA以及rRNA的已知RNA修飾類型，這些修飾涵蓋對(duì)RNA轉(zhuǎn)錄、加工、定位、穩(wěn)定性以及翻譯等功能進(jìn)行不同作用。接著，文章介紹了上述RNA修飾在正常生理（如細(xì)胞應(yīng)激響應(yīng)、發(fā)育過(guò)程等）中具體如何發(fā)揮作用，此外，介紹了異常RNA修飾在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝疾病及腫瘤等病理狀態(tài)下通過(guò)影響RNA定位、線粒體功能以及細(xì)胞可塑性等方式發(fā)揮功能。最后對(duì)mRNA以及ASOs（antisense oligonucleotides）/siRNA等非編碼RNA作為藥物的修飾策略與應(yīng)用前景進(jìn)行了介紹。

本文系統(tǒng)總結(jié)了150余種RNA修飾通過(guò)動(dòng)態(tài)調(diào)控mRNA、tRNA與rRNA功能，構(gòu)建出連接轉(zhuǎn)錄與翻譯的“表觀轉(zhuǎn)錄組”系統(tǒng)，此系統(tǒng)通過(guò)修飾酶響應(yīng)環(huán)境信號(hào)，快速重編程蛋白質(zhì)合成以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換，失調(diào)則導(dǎo)致神經(jīng)、代謝疾病及癌癥的不良結(jié)局。本研究不僅闡明“代謝-修飾-翻譯”軸的調(diào)控框架，更推動(dòng)修飾應(yīng)用于mRNA疫苗、反義寡核苷酸等臨床療法，且為理解生命過(guò)程的動(dòng)態(tài)調(diào)控提供全新角度，標(biāo)志著從中心法則靜態(tài)模型向“可塑性轉(zhuǎn)錄后調(diào)控”理論的轉(zhuǎn)變，有助于促進(jìn)精準(zhǔn)RNA醫(yī)學(xué)與疾病生物標(biāo)志物的突破。

（doi: 10.1038/s41576-023-00645-2）

自20世紀(jì)60年代首次發(fā)現(xiàn)5-甲基胞苷（m⁵C）、N6-甲基腺苷（m⁶A）和假尿苷（Ψ）等天然RNA修飾，迄今已鑒定超過(guò)150種不同的RNA修飾，共同組成了復(fù)雜的"表觀轉(zhuǎn)錄組"。目前幾乎所有類型的RNA分子在生命周期中都會(huì)攜帶某種或某些化學(xué)修飾，這些修飾通過(guò)改變核苷酸的靜電荷、疏水表面和堿基配對(duì)能力，調(diào)控著RNA的穩(wěn)定性、空間結(jié)構(gòu)及其與蛋白質(zhì)分子互作的能力。此外，在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中發(fā)揮核心作用的三類主要RNA：信使RNA（mRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）和核糖體RNA（rRNA），這些修飾可在轉(zhuǎn)錄期間或轉(zhuǎn)錄后參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、RNA加工、出核、細(xì)胞定位及mRNA翻譯等多個(gè)環(huán)節(jié)，在基因轉(zhuǎn)錄與蛋白出核之間構(gòu)建起關(guān)鍵的分子橋梁，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響（圖1）。

高通量檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)修飾圖譜的繪制，揭示了修飾動(dòng)態(tài)響應(yīng)外界刺激（如氧化應(yīng)激、DNA損傷）的調(diào)控機(jī)制。異常修飾譜可導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育缺陷、代謝疾病及癌癥，而修飾的化學(xué)特性（如增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率）已被應(yīng)用于mRNA疫苗等臨床療法。

圖1：RNA修飾影響基因表達(dá)的所有步驟

RNA修飾類型
RNA修飾廣泛發(fā)生于腺苷（adenosine, A）、鳥苷（guanosine, G）、胞苷（cytidine, C）和尿苷（uridine, U）四種核苷中。嘌呤或嘧啶堿基最常見(jiàn)的修飾類型，包括甲基化、假尿苷化和腺苷-肌苷編輯（adenosine-to-inosine editing）。核糖部分的修飾化學(xué)多樣性有限，但2'-O-甲基化（2′-O-methylation, 2′-O-Me）在rRNA、tRNA和snRNA（small nuclear RNA）中頻繁出現(xiàn)。這些核苷酸修飾通過(guò)影響RNA加工、穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)，在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平調(diào)控基因表達(dá)（表1）。

表1：文中所述RNA修飾及其相應(yīng)修飾蛋白的關(guān)鍵示例

編碼RNA修飾
至少十種核苷酸修飾在真核mRNA中被報(bào)道（表1），確保其正確的轉(zhuǎn)錄、加工、亞細(xì)胞定位和翻譯。mRNA中最豐富的修飾是內(nèi)部位點(diǎn)（如m⁶A）和5′帽子結(jié)構(gòu)（如m⁷G、m⁶Am），這些修飾由METTL3-METTL14甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體、去甲基酶FTO/ALKBH5等至少20種調(diào)控蛋白動(dòng)態(tài)調(diào)控。m⁶A對(duì)基因表達(dá)受特定reader蛋白結(jié)合調(diào)控，包括YTH結(jié)構(gòu)域家族和HNRNP蛋白。YTHDF蛋白通常介導(dǎo)mRNA降解，也可促進(jìn)特定轉(zhuǎn)錄本翻譯；核內(nèi)reader蛋白YTHDC1則調(diào)控mRNA剪接、定位，并以m⁶A依賴方式調(diào)節(jié)染色質(zhì)可及性和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子沉默。5′帽子結(jié)構(gòu)的重要性體現(xiàn)在保護(hù)新生mRNA免受降解、促進(jìn)翻譯起始、并將mRNA標(biāo)記為"自身"以引導(dǎo)免疫系統(tǒng)區(qū)分內(nèi)外源核酸等多個(gè)層面。然而，m⁶Am對(duì)帽子依賴翻譯的影響具有雙重性，既可增強(qiáng)也可減弱翻譯效率。應(yīng)激狀態(tài)下，經(jīng)典帽子依賴翻譯被破壞，必需mRNA翻譯可通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry sites, IRES）或帽子獨(dú)立翻譯增強(qiáng)子維持，或由METTL3結(jié)合的3′UTRs區(qū)域介導(dǎo)的mRNA環(huán)化來(lái)促進(jìn)。非經(jīng)典帽子結(jié)構(gòu)（如NAD⁺、FAD衍生物）通過(guò)代謝物衍生而來(lái)，主要來(lái)源于NAD、FAD、CoA等代謝物和RNA相關(guān)輔因子，影響RNA穩(wěn)定性、線粒體功能及翻譯。

此外，mRNA中還存在Ψ、肌苷（inosine, I）、N1-甲基腺苷（N1-methyladenosine, m¹A）、5-甲基胞苷（5-methylcytidine, m⁵C）、5-羥甲基胞苷（5-hydroxymethylcytidine, hm⁵C）和N4-乙酰胞苷（N4-acetylcytidine, ac⁴C）等修飾。mRNA 3′聚腺苷酸尾（poly(A) tail）與5′帽結(jié)構(gòu)的直接互作可協(xié)同增強(qiáng)翻譯，該過(guò)程通過(guò)PABPC1蛋白與eIF4F復(fù)合物的蛋白-蛋白互作實(shí)現(xiàn)mRNA環(huán)化，促進(jìn)核糖體環(huán)路。METTL3可通過(guò)結(jié)合eIF3h或PABPC1促進(jìn)mRNA成環(huán)，增強(qiáng)癌基因特異性翻譯。盡管5′帽和m⁶A修飾的調(diào)控蛋白是否直接協(xié)作尚不明確，但不同調(diào)控蛋白集合在共轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后階段塑造mRNA修飾譜，在翻譯前或翻譯過(guò)程中穩(wěn)定或不穩(wěn)定mRNA，均參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（圖2）。

圖2：編碼RNA中的核苷酸修飾

非編碼RNA修飾
長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs, lncRNAs）通常由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄，攜帶m⁷G帽子、剪接和poly(A)尾，因此很可能安裝有與mRNA相似的修飾。目前已發(fā)現(xiàn)MALAT1、vault RNAs、HOTAIR、TERRA、7SK和XIST等lncRNA含有m⁶A、m⁵C和Ψ修飾。rRNA在轉(zhuǎn)錄和成熟過(guò)程中也廣泛修飾。但修飾最豐富的RNA類型是tRNA，人類細(xì)胞核編碼tRNA平均攜帶13種修飾（占?xì)埢?7%），線粒體tRNA平均含5種修飾（占8.7%）。單種修飾的精確功能嚴(yán)格取決于其在tRNA分子中的位置，影響轉(zhuǎn)錄、加工、剪接、穩(wěn)定性和亞細(xì)胞定位。反密碼子區(qū)修飾（如 wobble position的U34），結(jié)構(gòu)多樣性最高，可通過(guò)調(diào)控密碼子識(shí)別精度和翻譯效率，適應(yīng)基因的密碼子使用偏好。反密碼子環(huán)外的多數(shù)修飾穩(wěn)定tRNA-mRNA密碼子互作，從而增強(qiáng)解碼準(zhǔn)確性和效率。特定tRNA修飾可被單酶或多酶級(jí)聯(lián)進(jìn)一步修飾，形成5-甲酰胞苷（5-formylcytidine, f⁵C）、5-甲氧羰基甲基-2-硫尿苷（5-methoxycarbonylmethyl-2-thiouridine, mcm⁵s²U）、5-�；撬峒谆蜍眨�5-taurinomethyluridine, τm⁵U）和5-牛磺酸甲基-2-硫尿苷（τm⁵s²U）等復(fù)雜修飾。位于反密碼子或可變環(huán)的修飾如queuosine (Q)或m⁵C可保護(hù)tRNA免受內(nèi)切核酸酶切割。tRNA片段化是真核生物應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的保守反應(yīng)，某些tRNA來(lái)源片段與mRNA競(jìng)爭(zhēng)核糖體結(jié)合以調(diào)控應(yīng)激下的翻譯，其他片段則與Argonaute蛋白結(jié)合實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。tRNA片段的穩(wěn)定性和功能也受特定核苷酸修飾決定，例如Ψ修飾的tRNA片段在干細(xì)胞和癌細(xì)胞中選擇性抑制異常蛋白合成。

rRNA修飾（如2'-O-甲基化（2'-O-Me）和假尿苷（ψ））由snoRNA介導(dǎo)，影響核糖體生物發(fā)生和翻譯準(zhǔn)確性。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）修飾（如m⁶A、m⁵C）與mRNA類似，但功能多與翻譯無(wú)關(guān)。

圖3：tRNA反密碼子序列中的核苷酸修飾調(diào)控翻譯效率

RNA修飾的生理功能
所有細(xì)胞中能量消耗最大的過(guò)程是蛋白質(zhì)合成，必須由RNA修飾通過(guò)代謝物、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞代謝通路的直接調(diào)控來(lái)嚴(yán)格平衡合成與分解代謝。在響應(yīng)環(huán)境脅迫時(shí)，全局蛋白質(zhì)合成和轉(zhuǎn)錄被抑制，細(xì)胞轉(zhuǎn)而靶向翻譯應(yīng)激特異性調(diào)控蛋白，急性細(xì)胞應(yīng)激響應(yīng)完全在翻譯水平調(diào)控。RNA修飾蛋白通過(guò)去除翻譯抑制mRNA的m⁷G帽，導(dǎo)致mRNA降解并組裝成mRNA核糖核蛋白，在加工小體（processing bodies）和應(yīng)激顆粒（stress granules）中積累。

tRNA修飾在適應(yīng)蛋白合成中具多重調(diào)控作用。營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激可改變tRNA的氨�；剑瑢�(dǎo)致蛋白質(zhì)合成減慢或密碼子使用模式改變；擺動(dòng)位點(diǎn)（wobble position）修飾可產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄本特異性翻譯效應(yīng)并增強(qiáng)細(xì)胞適應(yīng)性，細(xì)胞缺失修飾在解決應(yīng)激誘導(dǎo)的蛋白聚集方面存在缺失。

干細(xì)胞分化研究揭示了RNA修飾如何連接應(yīng)激通路與蛋白合成以調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)。成體組織中慢周期或靜止的干細(xì)胞蛋白合成效率較低以節(jié)省能量避免早衰，tRNA中m⁵C的缺失導(dǎo)致內(nèi)切核酸酶angiogenin對(duì)未修飾tRNA的切割增加，引起全局蛋白合成減少，從而維持干細(xì)胞功能并延遲分化；氧化應(yīng)激暴露同樣抑制m⁵C形成，減少蛋白合成并誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入分解代謝狀態(tài)。T細(xì)胞從靜息狀態(tài)向效應(yīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)也需要保護(hù)tRNA免受切割以維持蛋白合成。

全局翻譯抑制還涉及rRNA加工抑制，未加工rRNA儲(chǔ)存在核仁直至應(yīng)激消除，核仁動(dòng)態(tài)變化可激活腫瘤抑制蛋白p53和應(yīng)激信號(hào)通路。rRNA修飾也調(diào)控轉(zhuǎn)錄和成熟過(guò)程，例如NSUN5缺失去除28S rRNA C3782位的m5C，降低蛋白合成且促進(jìn)應(yīng)激下的適應(yīng)性翻譯程序，并顯著延長(zhǎng)生物體壽命。因此，RNA修飾譜隨著微環(huán)境的改變而動(dòng)態(tài)變化，通過(guò)靶向翻譯啟動(dòng)細(xì)胞應(yīng)激響應(yīng)，其失調(diào)可導(dǎo)致人類疾病。

病理性異常RNA修飾
RNA修飾酶基因的功能喪失突變，或抑制RNA分子修飾位點(diǎn)發(fā)生突變，均可引發(fā)人類疾病。異常修飾模式通過(guò)導(dǎo)致RNA降解或結(jié)構(gòu)改變影響基因表達(dá)，rRNA或tRNA的結(jié)構(gòu)變化影響核糖體結(jié)合或密碼子-反密碼子互作，從而降低蛋白合成效率和準(zhǔn)確性。調(diào)控異常mRNA翻譯通常降低細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境所需的代謝可塑性，這構(gòu)成了神經(jīng)與代謝疾病及癌癥發(fā)生的基礎(chǔ)。

神經(jīng)系統(tǒng)疾病
人腦對(duì)異常tRNA修飾譜尤為敏感，編碼tRNA修飾酶的基因突變常與神經(jīng)發(fā)育缺陷相關(guān)，導(dǎo)致小頭畸形、智力障礙等癥狀。當(dāng)tRNA修飾基因PUS7、PUS3（負(fù)責(zé)Ψ修飾）、FTSJ1（2′-O-Me修飾）或NSUN2（m⁵C修飾）發(fā)生突變時(shí)，可能出現(xiàn)矮小、攻擊行為或抑郁焦慮等行為改變。例如，NSUN2在小鼠前額葉皮層過(guò)表達(dá)足以引起抑郁樣行為，而其敲除則呈現(xiàn)抗抑郁表型。

動(dòng)物模型和人類干細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)揭示，tRNA低修飾會(huì)改變腦細(xì)胞功能。NSUN2缺失小鼠因神經(jīng)元分化延遲和運(yùn)動(dòng)能力降低而腦體積減小，該缺陷可通過(guò)抑制tRNA切割或N-乙酰半胱氨酸抗氧化干預(yù)挽救；NSUN2或FTSJ1缺失降低谷氨酸能神經(jīng)傳遞或突觸功能相關(guān)蛋白的密碼子特異性翻譯；TRMT1（負(fù)責(zé)N2,N2-二甲基鳥苷m^2,2G修飾）缺失改變?nèi)松窠?jīng)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性。METTL1（負(fù)責(zé)m⁷G修飾）敲除導(dǎo)致小鼠胚胎干細(xì)胞在自我更新和神經(jīng)分化必需基因的翻譯過(guò)程中發(fā)生核糖體停滯。

腦發(fā)育中的神經(jīng)元亞型分化等關(guān)鍵階段主要在翻譯水平調(diào)控且依賴線粒體代謝；樹(shù)突和軸突的復(fù)雜結(jié)構(gòu)需要遠(yuǎn)離細(xì)胞體的局部蛋白合成，800多種mRNA在樹(shù)突-軸突區(qū)室的翻譯速率高于細(xì)胞體，YTHDF蛋白促進(jìn)m⁶A修飾mRNA向神經(jīng)突的定位。在果蠅中，Ythdf與Fmr1（FMRP同源物）互作，F(xiàn)MRP通過(guò)調(diào)控m⁶A修飾RNA的穩(wěn)定性、翻譯和核-質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)影響神經(jīng)元突觸可塑性。FMR1表觀遺傳沉默導(dǎo)致脆性X綜合征，該病患者腦組織RNA呈低編輯狀態(tài)，自閉癥患者也存在廣泛的RNA編輯失調(diào)。

代謝疾病
線粒體疾病是最常見(jiàn)的遺傳性代謝疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，由氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）缺失導(dǎo)致。核基因編碼的線粒體tRNA或rRNA修飾酶突變，以及線粒體基因組影響這些修飾的突變，均可通過(guò)破壞線粒體蛋白合成引發(fā)線粒體疾病。線粒體基因組僅編碼22個(gè)tRNA、2個(gè)rRNA和13個(gè)OXPHOS系統(tǒng)蛋白，NSUN3介導(dǎo)的線粒體tRNA^Met反密碼子序列34位m⁵C修飾缺失即可導(dǎo)致線粒體基因翻譯抑制，NSUN3功能喪失突變患者表現(xiàn)為復(fù)合線粒體呼吸鏈缺陷和早發(fā)性線粒體腦肌病。TRMT5突變同樣導(dǎo)致多種線粒體呼吸鏈復(fù)合體缺陷，該酶在反密碼子環(huán)37位形成N1-甲基鳥苷（m¹G），穩(wěn)定tRNA-核糖體互作，其缺失引起+1位移碼，導(dǎo)致全局和線粒體翻譯缺陷。ALKBH7在線粒體前tRNA區(qū)域去甲基化m^2,2G和m¹A，減少多順?lè)醋泳€粒體RNA加工，降低線粒體編碼tRNA水平和蛋白翻譯。

值得注意的是，某些修飾直接依賴特定營(yíng)養(yǎng)因子生成，腸道微生物來(lái)源的queuine合成Q修飾，其缺失減慢翻譯并激活未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response）；膳食來(lái)源的�；撬崾�τm5U和τm5s2U合成的底物，其缺失與心肌病、腎功能障礙和視網(wǎng)膜神經(jīng)元損傷相關(guān)，而補(bǔ)充�；撬峥筛纳平】祲勖TO1催化�；撬嵋蕾嚨木€粒體tRNA修飾，其缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠線粒體翻譯和呼吸活動(dòng)嚴(yán)重受損，人類MTO1突變也引發(fā)肥厚型心肌病、乳酸酸中毒、腦病和嬰兒肝衰竭。MELAS（線粒體肌病、腦病、乳酸酸中毒和卒中樣發(fā)作）綜合征患者的口服�；撬嵫a(bǔ)充III期臨床試驗(yàn)顯示，該治療干預(yù)有效增加線粒體tRNA^Leu(UUR)的�；撬嵋蕾囆揎棽p少卒中樣發(fā)作復(fù)發(fā)。

在糖尿病條件下，eIF4E帽結(jié)合活性降低導(dǎo)致某些胞質(zhì)mRNA的帽子依賴翻譯減少，盡管m⁶Am帽修飾不調(diào)節(jié)eIF4E結(jié)合，但FTO多態(tài)性仍與人類肥胖和2型糖尿病相關(guān)。肥胖小鼠中FTO上調(diào)導(dǎo)致其m⁶Am修飾靶基因（富集于代謝過(guò)程）下調(diào)，進(jìn)一步損害代謝協(xié)調(diào)。FTO基因多態(tài)性通過(guò)調(diào)控m⁶A/m⁶Am水平與肥胖、2型糖尿病相關(guān)，F(xiàn)TO敲除小鼠可抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。

癌癥
腫瘤發(fā)生各階段均需細(xì)胞代謝重編程以確保生存和生長(zhǎng)，而RNA修飾蛋白是響應(yīng)外部信號(hào)的關(guān)鍵調(diào)控因子。NSUN2缺失抑制tRNA中m⁵C形成，是首個(gè)在體內(nèi)證實(shí)抑制RNA修飾可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞化療敏感性的機(jī)制。單獨(dú)NSUN2缺失不致死，但增加tRNA片段化、降低全局蛋白合成并迫使腫瘤起始細(xì)胞進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)，喪失上調(diào)m⁵C修飾的能力使其對(duì)細(xì)胞毒性應(yīng)激高度敏感，5-氟尿嘧啶或順鉑處理后腫瘤再生被抑制。5-氮雜胞苷（5-azacytidine）抑制RNA和DNA的m⁵C形成常用于治療骨髓增生異常綜合征。

細(xì)胞質(zhì)tRNA擺動(dòng)位點(diǎn)的尿苷修飾同樣參與腫瘤發(fā)生，U34位的cm5U、mcm5U、mcm5s2U和ncm5U修飾由Elongator復(fù)合體介導(dǎo)，可促進(jìn)WNT驅(qū)動(dòng)腸腫瘤起始和乳腺癌轉(zhuǎn)移，同時(shí)增強(qiáng)糖酵解相關(guān)基因的密碼子依賴翻譯并促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞化療耐藥。Elongator復(fù)合體成員（ELP1-ELP6）缺失在不同癌基因背景下可分別促進(jìn)或抑制癌細(xì)胞存活，例如ELP3缺失通過(guò)激活p53依賴檢查點(diǎn)導(dǎo)致骨髓衰竭，但ELP3與p53同時(shí)失活則促進(jìn)白血病發(fā)生。NSUN3在線粒體tRNA^Met的C34位形成m⁵C及其衍生物f⁵C，其缺失降低線粒體OXPHOS組分翻譯，嚴(yán)重?fù)p害代謝可塑性，導(dǎo)致線粒體m⁵C缺陷腫瘤無(wú)法轉(zhuǎn)移，提示抑制線粒體翻譯是靶向轉(zhuǎn)移的潛在策略。
rRNA修飾也通過(guò)重編程翻譯支持轉(zhuǎn)化表型。急性髓系白血病（acute myeloid leukaemia, AML）中特有的2′-O-Me rRNA特征通過(guò)重定向氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA的最優(yōu)密碼子使用，促進(jìn)白血病干細(xì)胞惡性自我更新。該修飾由C/D box小核仁核糖核蛋白（snoRNP）復(fù)合體催化，提供了通過(guò)snoRNA反義寡核苷酸（ASO）靶向特定2′-O-Me位點(diǎn)破壞白血病干細(xì)胞基因表達(dá)程序的可能性。內(nèi)部m⁶A修飾在多數(shù)癌癥中均有功能報(bào)道，首個(gè)METTL3抑制劑STM-2457已于2022年進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)，但METTL3對(duì)非轉(zhuǎn)化細(xì)胞也至關(guān)重要，其抑制難以選擇性靶向癌細(xì)胞。

相比之下，靶向m⁶A reader蛋白YTHDF2是更有前景的替代策略，YTHDF2缺失選擇性根除白血病干細(xì)胞，通過(guò)增加m⁶A修飾的TNFR2 mRNA穩(wěn)定性，上調(diào)白血病細(xì)胞的TNF誘導(dǎo)凋亡，但正常造血干細(xì)胞功能不受影響。然而長(zhǎng)期YTHDF2缺失會(huì)導(dǎo)致造血干細(xì)胞耗竭，因促炎基因上調(diào)引發(fā)干細(xì)胞功能衰退。其他mRNA修飾如m¹A和m⁵C也能增強(qiáng)癌細(xì)胞特定轉(zhuǎn)錄本的翻譯，但這些修飾同時(shí)在更高化學(xué)計(jì)量的tRNA中共存，抑制了精確分子機(jī)制的理解。

圖4：反密碼子tRNA修飾的細(xì)胞背景依賴性功能

RNA修飾的臨床應(yīng)用
隨著對(duì)天然RNA修飾如何影響編碼和非編碼RNA分子機(jī)制的深入理解，治療機(jī)會(huì)不斷涌現(xiàn)，既包括糾正病理性異常修飾，也包括通過(guò)在臨床使用的RNA中引入天然或合成修飾來(lái)提升療效。

編碼RNA
特定核苷酸修飾穩(wěn)定mRNA并增強(qiáng)翻譯的能力已被廣泛用于疫苗接種或治療性蛋白遞送。目前ClinicalTrials.gov數(shù)據(jù)庫(kù)中已列出超過(guò)450項(xiàng)使用mRNA疫苗的臨床研究，包括靶向感染、癌癥和遺傳病的個(gè)性化mRNA疫苗。治療性體外轉(zhuǎn)錄RNA應(yīng)盡可能模擬天然成熟胞質(zhì)mRNA，包含5′帽、poly(A)尾、UTR及內(nèi)部核苷酸修飾，以增強(qiáng)翻譯并將外源RNA識(shí)別為"自身"而避免先天免疫降解。

外源RNA常被模式識(shí)別受體（pattern-recognition receptors, PRRs）識(shí)別，而特定核苷酸修飾可影響PRR識(shí)別并調(diào)節(jié)炎癥因子釋放。肌苷可阻止MDA5介導(dǎo)的免疫信號(hào)，某些核糖甲基化抑制TLR7下游的細(xì)胞因子產(chǎn)生。ψ或N1-甲基假尿苷（m¹ψ）修飾的mRNA通過(guò)TLR7通路免疫原性低，且不易激活蛋白激酶R（protein kinase R, PKR），在PKR磷酸化缺失時(shí)eIF2α促進(jìn)翻譯前起始復(fù)合體形成，使mRNA更穩(wěn)定翻譯。ψ和m¹ψ修飾還能幫助解析停滯核糖體并防止翻譯提前終止，提高核糖體密度，這些特性促成了COVID-19 mRNA疫苗的快速成功開(kāi)發(fā)。原則上，任何影響RNA結(jié)構(gòu)和功能的修飾都可應(yīng)用于mRNA疫苗或蛋白替代療法，但其有效性和安全性信息仍有待研究。

小非編碼RNA
獲批的小非編碼RNA療法包括反義寡核苷酸（antisense oligonucleotides, ASOs），用于降低或增加蛋白水平或改善功能。ASO治療劑均經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾，如脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy, SMA）治療藥物nusinersen，其2′-O-甲氧乙基修飾結(jié)合硫代磷酸骨架，含完全甲基化的m⁵C和m⁵U。ASO也已獲批用于杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良和遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性所致多發(fā)性神經(jīng)病。RNA干擾通路編程使用的小干擾RNA（small interfering RNAs, siRNAs）是另一新興療法，patisiran和givosiran已獲批用于遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性和急性肝卟啉癥，其特征是完全修飾的核苷酸序列，包括硫代磷酸酯、2′-O-Me、2′-MOE和2′-脫氧-2′-氟（2′-F）組合。

工程化tRNA在糾正提前終止密碼子方面潛力巨大。約10-15%的遺傳病由無(wú)義突變導(dǎo)致，人工tRNA可繞過(guò)終止信號(hào)摻入正確氨基酸。反密碼子編輯的抑制性tRNA（ACE-tRNAs）已在囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)因子（CFTR）基因無(wú)義突變中恢復(fù)通道功能，脂質(zhì)納米顆粒遞送的工程化抑制tRNA（sup-tRNAs）可在小鼠和患者來(lái)源的鼻上皮中恢復(fù)功能性CFTR產(chǎn)生。另一種策略是通過(guò)工程化snoRNA將終止密碼子中的尿苷轉(zhuǎn)化為Ψ，從而恢復(fù)翻譯，該技術(shù)已在CFTR G542X無(wú)義突變和Hurler綜合征Idua基因W402X突變的小鼠模型中驗(yàn)證有效，但如何特異性靶向選定轉(zhuǎn)錄本及組織遞送仍是待解決的問(wèn)題。tRNA修飾通過(guò)提高含最優(yōu)密碼子轉(zhuǎn)錄本的翻譯保真度、準(zhǔn)確性和效率，還可用于上調(diào)蛋白合成，如m1G37修飾可穩(wěn)定密碼子-反密碼子互作，而tRNA來(lái)源片段可通過(guò)抑制應(yīng)激下蛋白合成成為潛在治療手段。

結(jié)論與未來(lái)展望
盡管迭代的檢測(cè)方法、分子技術(shù)和遺傳模型推動(dòng)了對(duì)RNA修飾生理與病理功能的理解，但要將表觀轉(zhuǎn)錄組全面整合到臨床應(yīng)用中，仍需克服許多局限和挑戰(zhàn)。

首要任務(wù)是推進(jìn)RNA修飾的繪制和定量方法，目前缺乏可靠、穩(wěn)定的高通量方法以在全基因組范圍同時(shí)檢測(cè)所有RNA修飾的類型。此外，其中大多數(shù)修飾不限于特定RNA類型，某些修飾蛋白同時(shí)靶向編碼和非編碼RNA，且不同RNA類型中個(gè)別修飾的化學(xué)計(jì)量差異顯著，使得解析修飾的RNA類型特異性功能極具挑戰(zhàn)性。頗具挑戰(zhàn)的是除tRNA和rRNA外，其他非編碼RNA的功能常不明確，難以闡明其修飾的重要性。未來(lái)在單細(xì)胞水平對(duì)所有RNA類型進(jìn)行高靈敏度、可重復(fù)的修飾動(dòng)態(tài)沉積和功能分析將提供關(guān)鍵信息。

其次，需要深入理解RNA修飾的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。RNA分子壽命直接依賴其修飾譜，但修飾一旦完成，其壽命可能超過(guò)相應(yīng)修飾酶的表達(dá)。成熟哺乳動(dòng)物tRNA半衰期約4天，而修飾酶常瞬時(shí)表達(dá)，導(dǎo)致修飾水平與修飾酶表達(dá)的相關(guān)性可能被扭曲。修飾功能常由特定reader蛋白介導(dǎo)，同一修飾在不同序列背景下可能因reader或eraser蛋白的存在與否而功能不同。

第三，靶向RNA修飾蛋白和RNA療法的藥物發(fā)現(xiàn)流程亟需優(yōu)化�，F(xiàn)有藥物常缺乏特異性，導(dǎo)致不良反應(yīng)，需通過(guò)計(jì)算預(yù)測(cè)模型、體外高通量酶促實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞通路互作研究加以改進(jìn)。RNA療法雖已利用修飾增強(qiáng)穩(wěn)定性、效力和特異性，但其藥理性質(zhì)可通過(guò)天然與合成化學(xué)修飾的組合及最優(yōu)序列上下文和位置確定進(jìn)一步優(yōu)化。最終，結(jié)合單細(xì)胞水平的比較分析與健康及患病人群細(xì)胞中的先進(jìn)分子、生化與細(xì)胞功能研究，將為RNA修飾進(jìn)一步整合到臨床應(yīng)用鋪平道路。
總之，當(dāng)前挑戰(zhàn)包括開(kāi)發(fā)單細(xì)胞分辨率修飾檢測(cè)技術(shù)、解析修飾酶動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)、提高靶向藥物特異性。未來(lái)需結(jié)合單細(xì)胞多組學(xué)與疾病模型，推動(dòng)RNA修飾在分層治療中的應(yīng)用。修飾化學(xué)特性的深入理解將優(yōu)化RNA療法設(shè)計(jì)，如聯(lián)合天然/合成修飾提升藥物穩(wěn)定性與靶向性。

參考文獻(xiàn)：
Delaunay S, Helm M, Frye M. RNA modifications in physiology and disease: towards clinical applications. Nat Rev Genet. 2023 Sep 15. doi: 10.1038/s41576-023-00645-2.

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