Nature文章分享：在體CRISPR screening技術(shù)助力發(fā)現(xiàn)增強CAR-T靶點
文章來源公眾號：生物快評 作者：bio2you
2025年9月24日, Nature發(fā)文《In vivo CRISPR screens identify modifiers of CAR T cell function in myeloma》，這篇文章是哈佛醫(yī)學(xué)院的Marcela V. Maus教授，她也是麻省總醫(yī)院細(xì)胞免疫治療項目的主任。
這里指的是CRISPR KO screening技術(shù)，簡單介紹一下：就是對一群T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)gRNA文庫，然后這群細(xì)胞中，某一些細(xì)胞亞群含有某一種基因敲除的表型。那么在給定一個篩選條件，讓能夠適應(yīng)這種條件的、基因缺失的細(xì)胞群體，優(yōu)勝劣汰出來。富集的T細(xì)胞在通過高通量測序分析是什么gRNA富集了，反推一下就知道是什么基因缺失了。
快速的結(jié)論
體外實驗中，敲除RASA2 和 SOCS1 可增強 T 細(xì)胞的擴增；而在體內(nèi)實驗中，缺失PTPN2、ZC3H12A 和 RC3H1則賦予 CAR T 細(xì)胞早期的選擇性生長優(yōu)勢。
值得注意的是，作者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期調(diào)控因子——細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子 1B（CDKN1B） 是限制 CAR T 細(xì)胞在體內(nèi)后期活性的重要因素。
敲除 CDKN1B可增強 BCMA CAR T 細(xì)胞對抗原的增殖和效應(yīng)功能，從而顯著提高腫瘤清除率和整體生存率。
目前在Google Scholar檢索，去掉引用，共有57萬“crispr screening”信息。
文章的細(xì)節(jié)1）是什么CRISPR篩選系統(tǒng)？
所用的是Mario’ library（有不同類型的gRNA文庫），該文庫靶向的是135個基因敲除，這些基因在一定程度上可能有T細(xì)胞的功能相關(guān)，每個基因有8個gRNA。對照無意gRNA有100個（靶向基因間區(qū)）。
這個篩選體系靶向的基因有限，所以敲除的靶點肯定在這個范圍內(nèi)，這限制了更大范圍的篩選。
這個篩選所用的載體
載體1：靶向BCMA的CAR（4-1BBZ結(jié)構(gòu)），這個CAR后面利用2A連接CD34t(短截體的CD34)，該載體是表達(dá)CAR所用，CD34t是便于檢測CAR表達(dá)。
載體2：gRNA載體，該載體通過U6驅(qū)動gRNA轉(zhuǎn)錄，注意這里含有TRAC gRNA和靶向基因gRNA，TRAC gRNA是有兩個目的：其一是為了避免后續(xù)體內(nèi)篩選的BCMA-CAR-T對宿主造成GvHD，其二是為了檢測和分選CD3陽性的T細(xì)胞，因為CD3陽性的T細(xì)胞即是未發(fā)生基因編輯的細(xì)胞。串聯(lián)PGK1啟動子驅(qū)動iCasp9表達(dá)，且iCasp9通過2A連接了一個篩選標(biāo)記LNGFR，icasp9是一個誘導(dǎo)性的安全開關(guān)，這些和篩選無關(guān)，可以不要。
2）這個篩選怎么操作的？
首先活化T細(xì)胞，然后制備含有BCMA-CAR的慢病毒和含有g(shù)RNA的文庫的慢病毒。
將上述慢病毒混合感染活化的T細(xì)胞，然后通過磁珠篩選去掉CD3陽性的T細(xì)胞，即得到了CD3陰性的經(jīng)過文庫編輯后的T細(xì)胞。
然后這些細(xì)胞通過尾靜脈注射到含有MM.1S小鼠體內(nèi)，在第21天在小鼠的骨髓中分離BCMA-CAR-T，最后通過測序關(guān)鍵敲除哪個基因的gRNA被富集了。
3）篩選得到什么基因敲除對于CAR-T比較好
紅色是富集的gRNA的基因，即敲除帶來優(yōu)勢的基因。
藍(lán)色為丟失的gRNA的基因，暗示敲除帶來不利影響。
因為這個是一個富集篩選，所以我們通常更加相信富集的敲除的基因更可靠。
題外話：基因敲除篩選真的就是一個“一網(wǎng)打盡”的系統(tǒng)嗎？
目前很多課題組做全基因組基因敲除篩選、過表達(dá)篩選，然后按照自己的觀察指標(biāo)，進行基因富集。對得到靶點后再進行驗證，通常在加上單細(xì)胞測序的數(shù)據(jù)。
似乎“Screening”+“single-cell Seq”是發(fā)高分文章的套路。
實際上，某個領(lǐng)域的一些關(guān)鍵基因很多都在早期都被發(fā)現(xiàn)了。目前想通過大規(guī)模的篩選，很難得到你想要的“新”的靶點，大概率是對舊的機制、通路的縫縫補補。
測序和篩選的錢，大概率只是得到了一個文章的“頭”和“引子”。
其次你篩選得到的清單，非常困難得到一個不影響“其他功能”，只有好處的靶點。
最后很多人的篩選標(biāo)準(zhǔn)是“細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活”，很多時候篩選得到了一些抗凋亡、促增長、或者是促癌基因，你所觀察到的指標(biāo)只是“細(xì)胞長快了為富集”，而不是因為你的篩選壓力而富集。
怎么從別人的篩選中獲得自己關(guān)心的靶點呢
首先，一般文章會提供篩選的清單，頭部的靶點可能已經(jīng)被作者重復(fù)，那么次要的靶點可以下載下來再看看。如果沒有現(xiàn)成的清單excel，直接下載測序數(shù)據(jù)，自己用軟件跑一下。
最后我們可以通過專利檢索一下，如果一年左右，作者沒有對發(fā)現(xiàn)靶點進行保護，大概率這些東西沒有什么實際作用。
