二甲雙胍通過(guò)DNA甲基化和羥甲基化雙向調(diào)控減輕肝損傷的保護(hù)機(jī)制
近日，鄭州大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科劉峰宇博士和仝然博士為共同第一作者，孫同文教授為通訊作者，首次系統(tǒng)探討了經(jīng)典降糖藥物二甲雙胍（Metformin）對(duì)膿毒癥相關(guān)肝損傷（Sepsis-associated liver injury, SLI）的保護(hù)作用及其表觀遺傳學(xué)機(jī)制。研究采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）誘導(dǎo)的SD膿毒癥大鼠模型，結(jié)合RRBS（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）與oxRRBS（oxidative RRBS）甲基化測(cè)序技術(shù)，從全基因組層面揭示CLP誘導(dǎo)的SLI狀態(tài)下肝臟組織DNA甲基化（5mC）和羥甲基化（5hmC）圖譜的異常變化，并利用RNA-seq轉(zhuǎn)錄組分析驗(yàn)證二甲雙胍通過(guò)雙向調(diào)控DNMTs/TET2酶活性系統(tǒng)，逆轉(zhuǎn)異常甲基化修飾，最終改善肝臟炎癥與代謝功能障礙的分子機(jī)制。本研究鑒定出受甲基化修飾調(diào)控的A1cf和Atxn7l1兩個(gè)關(guān)鍵差異表達(dá)基因，為膿毒癥相關(guān)肝損傷的精準(zhǔn)治療提供了新的分子靶點(diǎn)和理論依據(jù)。相關(guān)研究成果以“Metformin attenuated sepsis-related liver injury by modulating the DNA methylation and hydroxymethylation landscape”為題發(fā)表于《International Immunopharmacology》期刊。
本研究通過(guò)RRBS和oxRRBS全面評(píng)估了肝組織中的全基因組DNA甲基化和羥甲基化模式。結(jié)果顯示，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）誘導(dǎo)的膿毒癥相關(guān)肝損傷（SLI）與全基因組DNA低甲基化和高羥甲基化相關(guān)，二甲雙胍干預(yù)后可以部分逆轉(zhuǎn)上述表觀遺傳修飾改變。CLP組中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）和TET2蛋白的表達(dá)水平上調(diào)，且受二甲雙胍調(diào)控。另外，差異甲基化和羥甲基化基因的功能富集分析顯示其主要參與氧化磷酸化和代謝通路。有趣的是，整合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)成功鑒定出兩個(gè)關(guān)鍵基因A1cf和Atxn7l1，其在CLP中表現(xiàn)為甲基化增加和表達(dá)下調(diào)，而這些改變可在二甲雙胍干預(yù)后逆轉(zhuǎn)。這些發(fā)現(xiàn)為SLI的表觀遺傳機(jī)制提供了新見(jiàn)解，并表明二甲雙胍通過(guò)調(diào)控DNA甲基化和羥甲基化發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。
研究要點(diǎn)
研究方法
動(dòng)物模型構(gòu)建：40只成年雄性SD大鼠，分為4組：假手術(shù)組（SC）、假手術(shù)+二甲雙胍組（SC-MET）、CLP模型組（CLP）、CLP+二甲雙胍組（CLP-MET）。CLP模型通過(guò)盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)模擬膿毒癥，二甲雙胍（100 mg/kg）在術(shù)后1小時(shí)腹腔注射。
肝損傷與炎癥指標(biāo)檢測(cè)：檢測(cè)血清中ALT、AST、TNF-α、IL-6、IL-1β水平；肝組織H&E染色評(píng)估病理變化（如炎癥浸潤(rùn)、出血）。
DNA甲基化與羥甲基化分析（RRBS+oxRRBS）：肝組織基因組DNA經(jīng)MspI酶切后，分別進(jìn)行RRBS和oxRRBS建庫(kù)測(cè)序，鑒定差異甲基化區(qū)域（DMRs）和差異羥甲基化區(qū)域（DhMRs）。
功能注釋?zhuān)和ㄟ^(guò)KEGG富集分析D(h)MRs相關(guān)基因的生物學(xué)通路。
轉(zhuǎn)錄組分析（RNA-seq）：提取肝組織總RNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)并測(cè)序，鑒定差異表達(dá)基因（DEGs），并進(jìn)行KEGG通路富集。
多組學(xué)整合分析：交叉比對(duì)D(h)MRs與DEGs，篩選受甲基化/羥甲基化調(diào)控的關(guān)鍵基因（如A1CF、ATXN7L1），并通過(guò)Western blot驗(yàn)證蛋白表達(dá)。
結(jié)果圖形
（1）二甲雙胍進(jìn)一步調(diào)控CLP引起的全局DNA甲基化/羥甲基化變化
通過(guò)RRBS和oxRRBS技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，CLP組大鼠肝組織表現(xiàn)出全局DNA高甲基化和高羥甲基化，而二甲雙胍干預(yù)（CLP-MET組）顯著降低甲基化水平并進(jìn)一步升高羥甲基化。Western blot結(jié)果顯示CLP組DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和TET2表達(dá)上調(diào)，二甲雙胍逆轉(zhuǎn)了DNMTs表達(dá)并進(jìn)一步促進(jìn)TET2表達(dá)。這表明二甲雙胍通過(guò)調(diào)控甲基化酶和去甲基化酶活性，重建了SLI中的表觀遺傳譜。
（2）CLP與二甲雙胍作用下差異（羥）甲基化修飾區(qū)域的基因注釋
對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域的D(h)MRs進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，CLP組的高甲基化DMRs主要富集于氧化磷酸化和代謝通路，而二甲雙胍干預(yù)后，高甲基化DMRs轉(zhuǎn)向富集于腎酸分泌和糖胺聚糖降解等通路。羥甲基化分析顯示類(lèi)似趨勢(shì)，提示二甲雙胍通過(guò)調(diào)節(jié)代謝相關(guān)基因的表觀狀態(tài)緩解肝損傷。
圖3：DMR相關(guān)基因的KEGG通路分析。
（3）轉(zhuǎn)錄組分析揭示二甲雙胍調(diào)控的表觀遺傳相關(guān)基因表達(dá)變化
RNA-seq結(jié)果顯示，CLP組共有3307個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因富集于TNF、NF-κB等炎癥通路，下調(diào)基因富集于代謝通路。二甲雙胍干預(yù)后，629個(gè)DEGs被逆轉(zhuǎn)，上調(diào)基因轉(zhuǎn)向代謝通路，下調(diào)基因涉及炎癥通路，表明二甲雙胍通過(guò)抑制炎癥、促進(jìn)代謝修復(fù)發(fā)揮保護(hù)作用。
（4）多組學(xué)整合鑒定膿毒癥中受甲基化/羥甲基化異常調(diào)控的DEGs
通過(guò)交叉分析甲基化、羥甲基化和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出兩個(gè)關(guān)鍵基因A1CF和ATXN7L1。CLP組中這兩個(gè)基因啟動(dòng)子甲基化升高、表達(dá)下調(diào)，而二甲雙胍逆轉(zhuǎn)了這一趨勢(shì)。Western blot驗(yàn)證其蛋白水平變化一致，提示A1CF和ATXN7L1兩個(gè)關(guān)鍵基因可能是二甲雙胍表觀遺傳調(diào)控的核心靶點(diǎn)。
結(jié)論和啟示
本研究首次系統(tǒng)闡明了二甲雙胍通過(guò)調(diào)節(jié)DNA甲基化/羥甲基化平衡緩解SLI的機(jī)制，其中主要聚焦其表觀遺傳調(diào)控功能，揭示其對(duì)DNMTs和TET2的雙向調(diào)控作用。具體而言，二甲雙胍通過(guò)逆轉(zhuǎn)CLP誘導(dǎo)的DNA高甲基化、促進(jìn)羥甲基化，調(diào)控關(guān)鍵基因（如A1CF、ATXN7L1）表達(dá)，最終減輕肝損傷。本研究局限性在于篩選的候選基因（A1CF、ATXN7L1）功能需進(jìn)一步驗(yàn)證，且樣本量較小。未來(lái)可擴(kuò)大樣本并開(kāi)展功能實(shí)驗(yàn)，深化機(jī)制研究。
RRBS+oxRRBS技術(shù)在本研究中的核心作用
RRBS覆蓋CpG富集區(qū)域，oxRRBS特異性識(shí)別5hmC，兩者結(jié)合實(shí)現(xiàn)了全基因組范圍內(nèi)5mC和5hmC的精準(zhǔn)定量，為甲基化/羥甲基化與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的整合提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)，直接揭示表觀遺傳修飾與基因表達(dá)變化相關(guān)性。同時(shí)通過(guò)D(h)MRs富集分析揭示二甲雙胍調(diào)控代謝和炎癥通路的具體靶點(diǎn)，凸顯其在表觀遺傳研究中的不可替代性。
RRBS+oxRRBS組合適用于疾病模型中的表觀機(jī)制探索，尤其在代謝性疾病、炎癥和藥物干預(yù)研究中，可高效揭示環(huán)境-表觀-基因互作網(wǎng)絡(luò)。
參考文獻(xiàn)：
Liu F, Tong R, Song H, Gong L, Ding X, Liu H, Li H, Liu L, Wang Y, Zhang R, Sun T. Metformin attenuated sepsis-related liver injury by modulating the DNA methylation and hydroxymethylation landscape. Int Immunopharmacol. 2025 May 7;157:114748.doi: 10.1016/j.intimp.2025.114748.
本研究通過(guò)RRBS和oxRRBS全面評(píng)估了肝組織中的全基因組DNA甲基化和羥甲基化模式。結(jié)果顯示，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）誘導(dǎo)的膿毒癥相關(guān)肝損傷（SLI）與全基因組DNA低甲基化和高羥甲基化相關(guān)，二甲雙胍干預(yù)后可以部分逆轉(zhuǎn)上述表觀遺傳修飾改變。CLP組中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）和TET2蛋白的表達(dá)水平上調(diào)，且受二甲雙胍調(diào)控。另外，差異甲基化和羥甲基化基因的功能富集分析顯示其主要參與氧化磷酸化和代謝通路。有趣的是，整合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)成功鑒定出兩個(gè)關(guān)鍵基因A1cf和Atxn7l1，其在CLP中表現(xiàn)為甲基化增加和表達(dá)下調(diào)，而這些改變可在二甲雙胍干預(yù)后逆轉(zhuǎn)。這些發(fā)現(xiàn)為SLI的表觀遺傳機(jī)制提供了新見(jiàn)解，并表明二甲雙胍通過(guò)調(diào)控DNA甲基化和羥甲基化發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。
研究要點(diǎn)
- 二甲雙胍可能通過(guò)調(diào)控DNA甲基化和羥甲基化圖譜在SLI中發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。
- CLP誘導(dǎo)的SLI與全基因組DNA低甲基化和高羥甲基化相關(guān)。
- 二甲雙胍治療可部分逆轉(zhuǎn)SLI中全基因組DNA甲基化和羥甲基化的變化。
- 差異甲基化和羥甲基化基因參與氧化磷酸化和代謝通路。
- 整合DNA甲基化、羥甲基化和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定出A1CF和ATXN7L1為關(guān)鍵基因。
研究方法
動(dòng)物模型構(gòu)建：40只成年雄性SD大鼠，分為4組：假手術(shù)組（SC）、假手術(shù)+二甲雙胍組（SC-MET）、CLP模型組（CLP）、CLP+二甲雙胍組（CLP-MET）。CLP模型通過(guò)盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)模擬膿毒癥，二甲雙胍（100 mg/kg）在術(shù)后1小時(shí)腹腔注射。
肝損傷與炎癥指標(biāo)檢測(cè)：檢測(cè)血清中ALT、AST、TNF-α、IL-6、IL-1β水平；肝組織H&E染色評(píng)估病理變化（如炎癥浸潤(rùn)、出血）。
DNA甲基化與羥甲基化分析（RRBS+oxRRBS）：肝組織基因組DNA經(jīng)MspI酶切后，分別進(jìn)行RRBS和oxRRBS建庫(kù)測(cè)序，鑒定差異甲基化區(qū)域（DMRs）和差異羥甲基化區(qū)域（DhMRs）。
功能注釋?zhuān)和ㄟ^(guò)KEGG富集分析D(h)MRs相關(guān)基因的生物學(xué)通路。
轉(zhuǎn)錄組分析（RNA-seq）：提取肝組織總RNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)并測(cè)序，鑒定差異表達(dá)基因（DEGs），并進(jìn)行KEGG通路富集。
多組學(xué)整合分析：交叉比對(duì)D(h)MRs與DEGs，篩選受甲基化/羥甲基化調(diào)控的關(guān)鍵基因（如A1CF、ATXN7L1），并通過(guò)Western blot驗(yàn)證蛋白表達(dá)。
結(jié)果圖形
（1）二甲雙胍進(jìn)一步調(diào)控CLP引起的全局DNA甲基化/羥甲基化變化
通過(guò)RRBS和oxRRBS技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，CLP組大鼠肝組織表現(xiàn)出全局DNA高甲基化和高羥甲基化，而二甲雙胍干預(yù)（CLP-MET組）顯著降低甲基化水平并進(jìn)一步升高羥甲基化。Western blot結(jié)果顯示CLP組DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和TET2表達(dá)上調(diào)，二甲雙胍逆轉(zhuǎn)了DNMTs表達(dá)并進(jìn)一步促進(jìn)TET2表達(dá)。這表明二甲雙胍通過(guò)調(diào)控甲基化酶和去甲基化酶活性，重建了SLI中的表觀遺傳譜。
表1：D(h)MR、hyper-D(h)MR 和 hypo-D(h)MR 數(shù)量
圖1：二甲雙胍在CLP相關(guān)SLI下調(diào)控DNA甲基化和羥甲基化譜。
圖2：組間D(h)MR。
（2）CLP與二甲雙胍作用下差異（羥）甲基化修飾區(qū)域的基因注釋
對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域的D(h)MRs進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，CLP組的高甲基化DMRs主要富集于氧化磷酸化和代謝通路，而二甲雙胍干預(yù)后，高甲基化DMRs轉(zhuǎn)向富集于腎酸分泌和糖胺聚糖降解等通路。羥甲基化分析顯示類(lèi)似趨勢(shì)，提示二甲雙胍通過(guò)調(diào)節(jié)代謝相關(guān)基因的表觀狀態(tài)緩解肝損傷。
圖3：DMR相關(guān)基因的KEGG通路分析。
圖4：DhMRs相關(guān)基因的KEGG通路分析。
（3）轉(zhuǎn)錄組分析揭示二甲雙胍調(diào)控的表觀遺傳相關(guān)基因表達(dá)變化
RNA-seq結(jié)果顯示，CLP組共有3307個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因富集于TNF、NF-κB等炎癥通路，下調(diào)基因富集于代謝通路。二甲雙胍干預(yù)后，629個(gè)DEGs被逆轉(zhuǎn)，上調(diào)基因轉(zhuǎn)向代謝通路，下調(diào)基因涉及炎癥通路，表明二甲雙胍通過(guò)抑制炎癥、促進(jìn)代謝修復(fù)發(fā)揮保護(hù)作用。
圖5：在RNA表達(dá)中檢測(cè)到的基因。
（4）多組學(xué)整合鑒定膿毒癥中受甲基化/羥甲基化異常調(diào)控的DEGs
通過(guò)交叉分析甲基化、羥甲基化和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出兩個(gè)關(guān)鍵基因A1CF和ATXN7L1。CLP組中這兩個(gè)基因啟動(dòng)子甲基化升高、表達(dá)下調(diào)，而二甲雙胍逆轉(zhuǎn)了這一趨勢(shì)。Western blot驗(yàn)證其蛋白水平變化一致，提示A1CF和ATXN7L1兩個(gè)關(guān)鍵基因可能是二甲雙胍表觀遺傳調(diào)控的核心靶點(diǎn)。
圖6：A1CF和ATXN7L1的表達(dá)。
結(jié)論和啟示
本研究首次系統(tǒng)闡明了二甲雙胍通過(guò)調(diào)節(jié)DNA甲基化/羥甲基化平衡緩解SLI的機(jī)制，其中主要聚焦其表觀遺傳調(diào)控功能，揭示其對(duì)DNMTs和TET2的雙向調(diào)控作用。具體而言，二甲雙胍通過(guò)逆轉(zhuǎn)CLP誘導(dǎo)的DNA高甲基化、促進(jìn)羥甲基化，調(diào)控關(guān)鍵基因（如A1CF、ATXN7L1）表達(dá)，最終減輕肝損傷。本研究局限性在于篩選的候選基因（A1CF、ATXN7L1）功能需進(jìn)一步驗(yàn)證，且樣本量較小。未來(lái)可擴(kuò)大樣本并開(kāi)展功能實(shí)驗(yàn)，深化機(jī)制研究。
RRBS+oxRRBS技術(shù)在本研究中的核心作用
RRBS覆蓋CpG富集區(qū)域，oxRRBS特異性識(shí)別5hmC，兩者結(jié)合實(shí)現(xiàn)了全基因組范圍內(nèi)5mC和5hmC的精準(zhǔn)定量，為甲基化/羥甲基化與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的整合提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)，直接揭示表觀遺傳修飾與基因表達(dá)變化相關(guān)性。同時(shí)通過(guò)D(h)MRs富集分析揭示二甲雙胍調(diào)控代謝和炎癥通路的具體靶點(diǎn)，凸顯其在表觀遺傳研究中的不可替代性。
RRBS+oxRRBS組合適用于疾病模型中的表觀機(jī)制探索，尤其在代謝性疾病、炎癥和藥物干預(yù)研究中，可高效揭示環(huán)境-表觀-基因互作網(wǎng)絡(luò)。
參考文獻(xiàn)：
Liu F, Tong R, Song H, Gong L, Ding X, Liu H, Li H, Liu L, Wang Y, Zhang R, Sun T. Metformin attenuated sepsis-related liver injury by modulating the DNA methylation and hydroxymethylation landscape. Int Immunopharmacol. 2025 May 7;157:114748.doi: 10.1016/j.intimp.2025.114748.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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