affinity、avidity和functional avidity影響TCR-T抗腫瘤反應(yīng)的機制

文章來源公眾號：TCRshows           作者小小富minfu

數(shù)十年來，T細胞的過繼轉(zhuǎn)移已徹底改變了癌癥免疫治療。特別是TCR的基因工程在開發(fā)更精確和個性化的癌癥免疫療法方面取得了重要里程碑。然而，為了最大程度地發(fā)揮這一策略的優(yōu)勢，必須深入理解TCR affinity、avidity以及functional avidity在TCR及T細胞識別腫瘤相關(guān)抗原（TAA）過程中的作用，這對于持續(xù)改進過繼性T細胞治療至關(guān)重要。除了TCR相關(guān)參數(shù)外，調(diào)控T細胞活化的其他關(guān)鍵因素還包括TCR共受體對TCR- pMHC穩(wěn)定性和TCR信號傳導(dǎo)的影響、腫瘤表位密度以及TCR工程化T細胞中TCR的表達水平。這里描述了決定TCR特異性和T細胞活化的關(guān)鍵因素，并探討了這些概念如何應(yīng)用于癌癥特異性TCR引導(dǎo)的T細胞重定向。

1、TCR親和力：affinity、avidity與functional avidity
從TIL到TCR及CAR T細胞工程，T細胞在癌癥免疫治療的發(fā)展中標志著重要的里程碑。T細胞依靠其TCR，在MHC的背景下識別短肽表位。該受體屬于免疫球蛋白基因超家族，由兩個不同的α和β多肽鏈組成異源二聚體，存在于典型的αβ T細胞中。其胞外域參與抗原識別，包含可變區(qū)、恒定區(qū)以及一個含有二硫鍵的鉸鏈區(qū)，以穩(wěn)定TCR鏈間的相互作用。該結(jié)構(gòu)延伸至跨膜區(qū)和胞內(nèi)域，后者通過非共價方式與CD3γ、δ、ε和ζ蛋白結(jié)合，形成TCR-CD3復(fù)合物。當TCR正確識別相應(yīng)的pMHC，包括MHC類型與CD4/CD8共受體之間的匹配時，TCR會發(fā)生一系列構(gòu)象變化，從而產(chǎn)生第一激活信號。調(diào)控這一pMHC識別及后續(xù)T細胞活化的三個關(guān)鍵TCR參數(shù)是：TCR affinity、avidity和functional avidity（圖1）。TCR affinity是控制T細胞對抗原敏感性的關(guān)鍵因素，定義為單個TCR與pMHC配體之間相互作用的強度。它通常由結(jié)合速率（kon）和解離速率（koff）決定，并以平衡解離常數(shù)（KD）表示。如果TCR affinity涉及單個受體，那么TCR avidity則衡量多個TCR-pMHC結(jié)合的強度，并考慮其他分子（如TCR共受體）在相互作用中的影響，而functional avidity則代表T細胞在不同肽表位濃度下的適應(yīng)性和活性。平均functional avidity通常以EC50濃度表示，即達到T細胞群體半數(shù)最大激活所需的肽劑量。盡管生理條件下的TCR affinity范圍可從1µM到100µM，但多項研究指出，包括抗腫瘤T細胞反應(yīng)在內(nèi)的T細胞最大活性的親和力閾值為5–10µM的肽表位。在一項對天然TCR與TCR-like CAR的比較研究中，發(fā)現(xiàn)TCR-like CAR中抗體片段的親和力是實現(xiàn)更優(yōu)T細胞反應(yīng)的關(guān)鍵因素。在此研究中，TCR affinity無法提升至5µM以上，而TCR-like CAR則表現(xiàn)出在nM范圍內(nèi)的更高親和力閾值。相反，一項傳統(tǒng)高親和力單鏈TCR與TCR-like CAR的比較顯示，盡管TCR-like CAR的表達水平更高，但其識別配體的敏感性較低，這可能與其信號動力學(xué)有關(guān)。在一組針對NY-ESO-1且親和力增強但仍處于生理范圍內(nèi)的TCR中，經(jīng)TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞能夠?qū)Ω哂?µM的親和力產(chǎn)生響應(yīng)，表明親和力可能限制T細胞的最大激活。這一現(xiàn)象很可能是由于超過閾值后TCR affinity對TCR avidity的貢獻減少所致。此外，基于12種TCR-pMHC相互作用表型模型的計算分析表明，TCR affinity可能并非T細胞反應(yīng)的可靠指標。

●圖1 TCR與pMHC之間的相互作用。T細胞通過pMHC識別腫瘤肽表位。多個參數(shù)會影響T細胞（包括經(jīng)TCR工程改造的T細胞）對pMHC的敏感性。TCR affinity描述的是單個TCR與pMHC之間相互作用的強度，通常使用SPR技術(shù)進行測量。而TCR avidity則反映的是多個TCR與多個pMHC之間的整體結(jié)合情況。因此，常使用由多個通過鏈霉親和素-生物素復(fù)合物連接并標記熒光染料的pMHC組成的多聚體來染色抗原特異性T細胞，并測定其TCR avidity。該參數(shù)還考慮了T細胞共受體（如CD8）在穩(wěn)定TCR-pMHC結(jié)合中的作用。與TCR avidity密切相關(guān)的是functional avidity，它體現(xiàn)T細胞針對靶抗原的應(yīng)答能力，表現(xiàn)為T細胞的活化和效應(yīng)功能，包括T細胞增殖、抗腫瘤細胞毒性、細胞因子分泌、活化標志物上調(diào)等。

TCR的特異性是在一個成熟過程中獲得的，該過程基于可變區(qū)（V）、連接區(qū)（J）以及僅在β鏈中存在的多樣性（D）TCR片段的體細胞重排。這些重排產(chǎn)生近乎無限多樣的具有不同特異性的TCR庫，其中包括識別自身抗原的TCR，即人體內(nèi)天然表達的抗原。在過繼性T細胞治療中靶向的許多TAAs都是可在健康組織中同樣存在的自身抗原。由于針對自身反應(yīng)性淋巴細胞的陰性選擇機制，對自身抗原有高親和力的T細胞克隆通常會被清除。因此，在循環(huán)T細胞中針對TAAs的高親和力TCR頻率較低。事實上，天然的癌癥特異性TCR通常難以對生理水平的表位密度產(chǎn)生有效的T細胞應(yīng)答，這也解釋了為何腫瘤能夠逃避T細胞的識別。相反，具有更高親和力以及更長TCR-pMHC結(jié)合動力學(xué)半衰期的TCR通常能引發(fā)更強的T細胞應(yīng)答，因為它們可以感知更低濃度的肽類表位。由于T細胞庫經(jīng)過編輯，循環(huán)T細胞對自身TAAs的親和力通常較低，因此體外親和力成熟成為增強T細胞識別低劑量肽表位能力的有效手段，甚至可使親和力提高達700倍。然而需要強調(diào)的是，親和力成熟并不總能解決低表位密度無法被識別的問題，已有研究表明，經(jīng)過親和力成熟且具有極高親和力的TCR雖能加快T細胞的反應(yīng)速度，卻可能無法響應(yīng)低密度的pMHC。這種識別缺失可通過降低TCR親和力來恢復(fù)，使得結(jié)合半衰期超過10秒；但若半衰期達到10²至10³秒范圍，則會導(dǎo)致敏感性喪失。在一項研究中，分析了使用不同肽段疫苗接種后，一組低親和力與高親和力癌癥特異性T細胞克隆庫的koff速率，發(fā)現(xiàn)解離速率與靶標識別及Ca2+動員密切相關(guān)。更重要的是，疫苗所用肽段的親和力顯著影響接種后患者體內(nèi)產(chǎn)生的T細胞克隆的avidity，其中天然肽段和低親和力肽段更有利于誘導(dǎo)出更高avidity的癌癥特異性T細胞。

2、表位密度的作用
T細胞的活化依賴于TCR-pMHC結(jié)合動力學(xué)，而這一過程又受到腫瘤細胞或APC膜上表位密度的影響。TAAs在細胞內(nèi)被加工處理后，與MHC分子結(jié)合形成pMHC，并呈現(xiàn)在細胞膜表面。腫瘤肽段與MHC分子之間的結(jié)合親和力已被證實與T細胞的應(yīng)答方式密切相關(guān)。研究表明，要實現(xiàn)腫瘤消退，p-MHC的親和力通常需達到10nM或更高。然而，由于抗原加工和呈遞機制存在缺陷，例如HLA分子水平下調(diào)，腫瘤肽抗原通常僅以少量形式表達于腫瘤細胞表面。在許多情況下，TAA水平通過基于mRNA的技術(shù)進行檢測，這可能無法準確反映T細胞實際可接觸的pMHC數(shù)量。在對預(yù)測的可變剪接形式進行肽組分析時發(fā)現(xiàn)，相較于正常轉(zhuǎn)錄本，癌癥特異性剪接變異體中過量存在的肽段僅占HLA I類表位的一小部分。此外，研究發(fā)現(xiàn)癌組織來源的轉(zhuǎn)錄本中含有更多的親水性氨基酸，這或許可以解釋為何癌癥特異性肽段較難被預(yù)測為MHC表位。一些研究嘗試利用針對NY-ESO-1和LAGE-1、過表達TAAs或分化相關(guān)TAAs的優(yōu)勢表位的高親和力可溶性TCR，來探究腫瘤細胞的免疫原性特征及其與表位密度的關(guān)系。該技術(shù)顯示，天然加工的TAA肽表位通常以每個細胞10至150個拷貝的數(shù)量呈現(xiàn)。這一數(shù)量足以激活抗原特異性T細胞，因為已有研究證明，單個TCR-pMHC相互作用即可誘導(dǎo)輔助性T細胞的活化。該pMHC可連續(xù)與不同的TCR分子結(jié)合，在與約200個TCR結(jié)合后觸發(fā)T細胞活化。此外，僅需3個pMHC復(fù)合物就足以促進細胞毒性T細胞的殺傷作用。然而，最近的研究將正確激活T細胞所需的pMHC配體數(shù)量提高到了至少90個。

盡管TCR affinity與T細胞感知較低抗原密度的能力直接相關(guān)，但TCR（功能）avidity更能預(yù)測當pMHC數(shù)量較少時，經(jīng)TCR改造的T細胞誘導(dǎo)腫瘤特異性反應(yīng)的能力。一些證據(jù)表明，在引發(fā)癌癥特異性T細胞反應(yīng)中，表位密度可能比TCR affinity或avidity起著更重要的作用。在非霍奇金B(yǎng)細胞淋巴瘤小鼠模型中，研究人員觀察到avidity在消除腫瘤負荷方面并未發(fā)揮主要作用。高親和力和低親和力的TCR均能成功清除小腫瘤，但都無法應(yīng)對較大的腫瘤。重要的是，高親和力T細胞的數(shù)量較之低親和力T細胞有所減少，很可能是因為前者更容易被誘導(dǎo)發(fā)生凋亡。通過調(diào)節(jié)腫瘤側(cè)的表位密度以降低avidity，可恢復(fù)T細胞的適應(yīng)性。在針對內(nèi)源性黑色素瘤抗原TRP1的研究中也描述了類似現(xiàn)象。另一項報告則認為，在體內(nèi)清除白血病細胞的主要因素是avidity，而非表位密度、p-MHC親和力或pMHC的穩(wěn)定性。這些發(fā)現(xiàn)支持存在一個affinity和avidity的閾值，超過該閾值后，進一步提高親和力或選擇超生理水平的avidity T細胞克隆，并不會轉(zhuǎn)化為更強的體內(nèi)反應(yīng)。因此，這挑戰(zhàn)了目前用于臨床前和臨床測試的T細胞克隆及TCR的選擇方式。然而，一項研究指出，針對白血病抗原WT1的高avidity TCR無法識別自然加工的WT1肽段。這些相互矛盾的研究凸顯了在癌癥識別背景下TCR-pMHC相互作用的復(fù)雜性，也揭示了僅依據(jù)最佳TCR affinity或avidity來篩選用于TCR工程化的T細胞克隆或TCR所存在的風(fēng)險。

3、TCR共受體的作用
TCR與相應(yīng)的pMHC結(jié)合后，TCR共受體CD4和CD8分別與MHC II類和I類分子的恒定區(qū)結(jié)合。通常認為，這些共受體通過兩種主要效應(yīng)增強T細胞的敏感性和反應(yīng)性：①穩(wěn)定TCR與對應(yīng)pMHC之間的弱相互作用；②將與共受體相關(guān)的酪氨酸激酶Lck招募至TCR信號復(fù)合物附近，從而促進TCR信號級聯(lián)的啟動。然而，盡管大量研究支持CD8在后一效應(yīng)中的作用，且TCR對CD8依賴的親和力閾值在60-120µM之間，但CD4僅能加速TCR觸發(fā)的信號傳導(dǎo)，并不能穩(wěn)定TCR-pMHC的相互作用。這一功能因CD4與MHC分子之間的親和力極低而受到質(zhì)疑。盡管如此，共受體參與在TCR與pMHC結(jié)合過程中的重要性可由以下事實說明：抗CD4和抗CD8抗體能夠減弱或阻斷某些抗體克隆甚至增強TCR與pMHC的相互作用程度。當TCR以低親和力與pMHC結(jié)合時，這種抗體介導(dǎo)的阻斷或增強效應(yīng)更為顯著。此外，CD8共受體胞外域所提供的穩(wěn)定性對于增強低親和力TCR-T細胞的活化至關(guān)重要，但對于高親和力TCR-T細胞則非必需。研究發(fā)現(xiàn)，CD8共受體通過改變TCR–pMHC相互作用的結(jié)合和解離速率，在亞優(yōu)親和力條件下提高結(jié)合效率。此外，CD8通過將TCR–pMHC I類復(fù)合物以依賴于CD8與MHC親和力的速度動員至膜微區(qū)，調(diào)節(jié)TCR的敏感性或觸發(fā)閾值。與胞外域不同，CD8的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域?qū)τ谠鰪奣細胞活化至關(guān)重要，且該作用獨立于TCR強度。降低這種依賴CD8/Lck的酪氨酸激酶活性會降低TCR的敏感性，從而阻礙T細胞效應(yīng)功能�；�于這些發(fā)現(xiàn)，TCR對其對應(yīng)pMHC親和力的不同決定了其對CD8依賴程度的差異。此外，使用pMHC多聚體的研究表明CD8在抗原特異性TCR結(jié)合中具有關(guān)鍵作用。在CD8結(jié)合位點帶有突變的四聚體選擇性地結(jié)合高avidity T細胞，而不結(jié)合低avidity T細胞。此外，CD8共受體的參與增強了T細胞與其對應(yīng)多聚體之間相互作用的avidity和穩(wěn)定性。上述觀察結(jié)果突顯了TCR共受體的存在或缺失如何影響T細胞與相應(yīng)pMHC分子之間的相互作用。此外，共受體表達水平或MHC結(jié)合能力的改變也會影響T細胞的功能。例如，HLA-A2 α3結(jié)構(gòu)域的人工突變導(dǎo)致CD8共受體無法結(jié)合，從而抑制了T細胞介導(dǎo)的靶細胞特異性裂解，但并未干擾TCR–pMHC的相互作用。相反，經(jīng)過人工改造、具有增強CD8結(jié)合能力的HLA-A*68分子則促進了T細胞增殖和細胞因子分泌。CD8與pMHC相互作用的功能效應(yīng)還體現(xiàn)在：只有在共受體參與的情況下，低親和力pMHC刺激的T細胞才能產(chǎn)生IFN-γ并表達CD107a表面標志。最后，CD8對低親和力TCR的協(xié)同作用引發(fā)了針對自身肽段的非期望性自身反應(yīng)問題。然而，T細胞可通過下調(diào)CD8膜表達來降低其functional avidity，從而減少自身反應(yīng)潛能。

4、癌癥特異性TCR的選擇
尋找癌癥特異性TCR候選物的一個良好起點，是從接受基于肽的疫苗或經(jīng)基因改造表達完整腫瘤抗原或負載目標肽段的DC治療后產(chǎn)生應(yīng)答的患者體內(nèi)分離獲得。使用DC的基于肽或抗原mRNA的癌癥疫苗策略，主要著眼于提高抗原呈遞細胞表面表位密度，以增強免疫系統(tǒng)對一種或多種TAA的反應(yīng)。當無法獲取患者自身細胞時，使用供體材料是另一種選擇�？赏ㄟ^自體負載肽的單核細胞來源DC來分離來自初始型庫的高親和力T細胞克隆，隨后用負載肽的PBMC進行重復(fù)刺激。然而，由于針對自身抗原的高度反應(yīng)性克隆較為稀少，這種方法可能難以實現(xiàn)。另一種獲得腫瘤反應(yīng)性T細胞克隆的來源是異基因材料。在此情況下，使用配型不匹配的供體細胞，旨在獲得針對完整pMHC復(fù)合物而非僅針對肽段的異源反應(yīng)性T細胞。此外，用目標肽段免疫過的轉(zhuǎn)基因小鼠也可作為具有通常表現(xiàn)出高親和力的鼠源TCR的來源。但該策略的一個缺點是異源TCR可能出現(xiàn)表位交叉反應(yīng)，從而導(dǎo)致脫靶反應(yīng)。為了提高TCR候選物的特異性和親和力，可利用病毒相關(guān)惡性腫瘤中的病毒抗原，但針對這些表位的反應(yīng)性T細胞的應(yīng)用將局限于部分患者。針對腫瘤新抗原的T細胞克隆正受到越來越多關(guān)注，因為這些新抗原是真正存在于癌組織而不存在于健康組織中的癌癥特異性表位。這些新抗原特異性T細胞為基因轉(zhuǎn)移提供了高度特異性的腫瘤反應(yīng)性TCR來源。然而，這一方法仍面臨一些挑戰(zhàn)，包括正確識別候選新表位，進而準確鑒定新抗原特異性T細胞克隆型，以及與腫瘤突變異質(zhì)性和這些抗原表位密度相關(guān)的其他難題。

無論其來源如何，所選的TCR候選物都應(yīng)通過pMHC多聚體結(jié)合實驗和功能實驗進行進一步測試，以確保其特異性和有效性（圖1）。這一點尤為重要，因為TCR對自身抗原的結(jié)合強度通常弱于例如病毒抗原。TCR親和力與T細胞免疫反應(yīng)之間的這種關(guān)聯(lián)，在表達病毒特異性TCR（高親和力）或腫瘤特異性TCR（低親和力）的工程化T細胞的不同反應(yīng)中得到了明確體現(xiàn)。此外，高親和力TCR通常比低親和力TCR更少依賴CD8共受體結(jié)合的作用。目前，pMHC多聚體被廣泛用作分析TCR avidity的首選方法，尤其適用于CD8陽性T細胞，而利用pMHC II類多聚體檢測抗原特異性CD4 T細胞仍存在挑戰(zhàn)。然而，如前所述，pMHC多聚體并不能提供有關(guān)functional avidity的信息，甚至可能無法識別重要的抗原特異性TCR庫。為此，研究人員開發(fā)了一種TCR缺陷的CD8陽性Jurkat衍生細胞系，用于快速且一致地評估克隆TCR的functional avidity。該細胞系稱為2D3，為T細胞functional avidity的測量提供了均一化/標準化的方法。它攜帶由活化T細胞核因子（NFAT）驅(qū)動的EGFP報告基因，從而使TCR激活與EGFP表達相關(guān)聯(lián)。這種細胞系的優(yōu)點之一是可通過任何類型的工程技術(shù)，方便地用編碼TCR的DNA或mRNA對其進行遺傳修飾。還有研究人員在另一種Jurkat衍生細胞系中引入了三種熒光蛋白：EGFP、CFP和mCherry。借助這三參數(shù)報告平臺，可同時分析三個在T細胞活化中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子——NFAT、NF-κB以及AP-1，以評估TCR功能。CD137是一種在CD8 T細胞刺激后24小時上調(diào)的活化標志物，可用作從初始庫中不同擴增T細胞亞群內(nèi)富集高親和力T細胞克隆的標記。篩選親和力優(yōu)化TCR的最大挑戰(zhàn)之一是降低靶內(nèi)或脫靶交叉反應(yīng)的風(fēng)險。描述了一種掃描方法，可在識別有效TCR的同時，精確定位可能具有危險性的TCR。該掃描方法首先基于affinity和functional avidity對天然TCR進行初篩，隨后對這些TCR進行親和力增強，并進一步開展親和力和功能表征。最終候選分子則通過X-scan進行比較，該系統(tǒng)將目標肽段的所有殘基逐一突變?yōu)樗�有可能的氨基酸。這種全面的篩選確保候選分子僅識別目標肽段，而不識別其他潛在肽段。

還強調(diào)了選擇正確APC以準確分析TCR親和力的重要性。為了分析TCR親和力并預(yù)測腫瘤特異性TCR基因工程T細胞的敏感性，通常使用不同濃度（一般在μM范圍）的肽抗原對APC進行致敏。其中，T2細胞系已成為此類實驗的金標準。該細胞系缺乏抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白（TAP），導(dǎo)致細胞表面存在大量“空載”HLA分子。盡管這一特性在肽致敏實驗中具有優(yōu)勢，但所使用的肽濃度遠高于生理水平，與自然加工的TAA肽相比，可能導(dǎo)致TCR親和力的誤判。事實上，常規(guī)實驗中常使用μM量級的肽段進行致敏，而若要模擬表位的生理濃度，T2細胞應(yīng)使用低nM濃度的肽段。當然，也可采用其他細胞系和檢測方法來評估腫瘤殺傷能力、細胞因子分泌（對由細胞因子風(fēng)暴引起的不良反應(yīng)至關(guān)重要），以及總體上任何反映T細胞適應(yīng)性和抗腫瘤反應(yīng)特異性的指標。

5、TCR-T細胞抗腫瘤反應(yīng)的改善
盡管TCR親和力與T細胞活性之間的相關(guān)性存在一些差異，但選擇高親和力TCR或提高低親和力TCR的親和力仍是增強抗腫瘤反應(yīng)的一種手段（圖2）。目前采用多種技術(shù)進行TCR親和力成熟，包括噬菌體展示系統(tǒng)——可實現(xiàn)pM級親和力的TCR、酵母TCR展示系統(tǒng)、結(jié)合丙氨酸掃描法以鑒定關(guān)鍵氨基酸殘基的哺乳動物逆轉(zhuǎn)錄病毒展示系統(tǒng)、替換TCR CDRs中的關(guān)鍵氨基酸，以及利用體細胞高頻突變的方法。另一方面，增強轉(zhuǎn)基因TCR的二聚化及其在T細胞表面的表達水平，是提高TCR avidity及T細胞功能的有效途徑。TCR工程中的一個難點在于轉(zhuǎn)基因TCR表達水平較低，這主要是由于其與內(nèi)源性TCR發(fā)生錯配，進而可能導(dǎo)致有害的免疫反應(yīng)，并與內(nèi)源性TCR競爭TCR復(fù)合物組裝機制。多年來已發(fā)展出多種技術(shù)來解決這一問題，這些方法針對TCR分子機制的不同方面（圖2）。其中一種策略是通過shRNA沉默內(nèi)源性TCR序列，從而增加細胞表面轉(zhuǎn)基因TCR的數(shù)量并減少內(nèi)源性TCR的存在，shRNA可被包含在攜帶轉(zhuǎn)基因TCR的同一載體中，或通過轉(zhuǎn)染siRNA實現(xiàn)。在這兩種情況下，siRNA均靶向TCR鏈的恒定區(qū)，以便同時抑制多種內(nèi)源性TCR序列。完全去除內(nèi)源性TCR可通過ZFNs、TALENs或近期更常用的CRISPR-Cas9系統(tǒng)等技術(shù)實現(xiàn)。盡管抑制內(nèi)源性TCR是減少TCR錯配的簡單方法，但其他策略則著眼于提高轉(zhuǎn)基因TCR的穩(wěn)定性，從而降低TCR錯配（圖2）。因此，用于T細胞基因工程的TCR已被引入額外的二硫鍵進行改造，該方法最近也被應(yīng)用于高親和力可溶性TCR。這一改造通過在TCR α鏈和β鏈中均引入半胱氨酸實現(xiàn)。另一種方法是將人TCR鏈的恒定區(qū)替換為小鼠αβ或人γδ TCR的恒定區(qū)。采用此策略時，αβ TCR鏈的恒定區(qū)被互換，以生成保留抗腫瘤功能的嵌合TCR。盡管此類改造增強了TCR的抗腫瘤功能，但異源成分的存在可能引發(fā)免疫原性，從而削弱細胞的作用效果。這一問題可通過將TCR恒定區(qū)的關(guān)鍵殘基替換為小鼠來源的相應(yīng)殘基來解決。此外，盡管該策略仍會產(chǎn)生錯配的TCR，但這些錯配產(chǎn)物無法與CD3結(jié)合，因而無功能活性。然而，使用這些策略仍可能發(fā)生錯配。為大幅避免錯誤配對，單鏈TCR基于TCR α和β鏈可變區(qū)通過連接肽融合而成。該結(jié)構(gòu)隨后與TCR β鏈恒定區(qū)連接形成單鏈TCR，而TCR α鏈恒定區(qū)則單獨添加，以允許招募CD3復(fù)合物。類似于完整的TCR，在可變區(qū)引入額外的二硫鍵可增強分子的穩(wěn)定性，并進一步提升工程化細胞的功能活性。上述針對內(nèi)源性TCR庫或轉(zhuǎn)基因TCR結(jié)構(gòu)的改造手段當然也可組合使用，以進一步提高TCR的avidity并促進更優(yōu)的T細胞應(yīng)答。

●圖2 增強腫瘤特異性TCR工程化T細胞。

6、TCR affinity與avidity在腫瘤特異性TCR工程T細胞中的臨床影響
用于癌癥治療的TCR工程化T細胞已在臨床應(yīng)用十余年，與此同時，人們普遍認為TCR affinity與avidity在有效清除癌細胞方面具有重要作用。經(jīng)過親和力成熟優(yōu)化的TCR工程化T細胞已成功誘導(dǎo)表達MART-1、gp100、WT1蛋白、CEA、NY-ESO-1、LAGE-1或MAGE-A家族的腫瘤產(chǎn)生臨床應(yīng)答。盡管提高親和力的抗腫瘤TCR可增強對低表位密度腫瘤細胞的識別能力，但也增加了與正常組織抗原發(fā)生交叉反應(yīng)的風(fēng)險。在使用親和力增強型TCR的臨床試驗中已觀察到脫靶識別和交叉反應(yīng)現(xiàn)象。采用從經(jīng)CEA肽免疫小鼠中分離出的親和力增強型HLA-A02限制性TCR改造的T細胞導(dǎo)致嚴重但短暫的結(jié)腸炎；而來自MAGE-A3疫苗接種轉(zhuǎn)基因小鼠的親和力增強型HLA-A02限制性MAGE-A3/A9/A12特異性TCR因識別腦細胞表達的MAGE-A12引發(fā)神經(jīng)毒性。另一款針對骨髓瘤和黑色素瘤開發(fā)的高親和力HLA-A*01限制性MAGE-A3特異性TCR導(dǎo)致前兩名接受治療的患者出現(xiàn)心源性休克并最終死亡。臨床前研究未預(yù)測到脫靶反應(yīng)，然而攜帶該TCR的工程化T細胞因識別橫紋肌特異性肌聯(lián)蛋白衍生肽而在患者中引起嚴重心臟組織損傷。盡管未經(jīng)親和力優(yōu)化的TCR也可能導(dǎo)致致命不良事件，但此案例凸顯了在未充分評估交叉反應(yīng)性前使用親和力增強型TCR所存在的風(fēng)險。為解決這一問題，研究人員建立了一套體外廣泛的臨床前測試流程，通過包括人類腫瘤細胞系、原代腫瘤樣本以及表達多種HLA等位基因的EBV轉(zhuǎn)化B淋巴母細胞系（B-LCLs）組合，并結(jié)合分子分析手段，評估親和力增強型MAGE-A4特異性TCR的安全性和有效性。在完成該測試程序后，獲得了一個具備安全臨床特征的親和力增強型TCR候選物，用于后續(xù)臨床試驗（NCT03132922，NCT04044768）。另一個與親和力增強型TCR相關(guān)的問題是持續(xù)性的本底信號激活，即對HLA分子的持續(xù)識別所致。雖然這一問題最初可能不會危及患者生命，但由于TCR–CD3下調(diào)及抑制性受體上調(diào)，會損害工程化T細胞的功能活性。值得慶幸的是，通過精細調(diào)節(jié)TCR親和力可能避免這種持續(xù)性激活。

內(nèi)源性TCR鏈與轉(zhuǎn)基因TCR鏈之間的錯配問題，盡管不僅限于高親和力TCR，但在過繼性TCR工程T細胞治療的安全性方面仍需引起重視。盡管迄今為止尚未報道由TCR錯配相關(guān)的新生反應(yīng)所引起的不良事件，但這一潛在問題可通過多種技術(shù)手段敲除內(nèi)源性TCR來解決（圖2），其中一些方法已在臨床試驗中得到驗證并取得積極結(jié)果。特別是CRISPR-Cas9系統(tǒng)因其簡便性、精確性和多功能性，徹底改變了癌癥治療中細胞基因工程的操作方式。最近，該方法已被用于難治性癌癥患者，通過多重編輯系統(tǒng)在導(dǎo)入腫瘤特異性TCR的同時，抑制T細胞內(nèi)源性TCR鏈以及負性免疫檢查點分子PD-1的表達。

對于難以分離出腫瘤特異性TCR的患者，使用健康供體的T細胞是一個不錯的替代方案。這一選擇的優(yōu)勢之一在于，可以篩選大量T細胞數(shù)量未受影響的供體，直至獲得最佳的高親和力TCR。該策略的另一個問題是供體TCR可能引起的脫靶反應(yīng)，這可通過與減少TCR錯配相同的技術(shù)手段加以預(yù)防。由于來自細胞毒性CD8 T細胞的TCR可能存在嚴重毒性，因此從Tregs或輔助性CD4 T細胞中獲得的高親和力TCR成為腫瘤特異性TCR的另一種來源。盡管使用Treg來源的TCR引發(fā)了人們對工程化輔助性CD4 T細胞在體內(nèi)重定向為Treg的擔(dān)憂，但目前在患者中尚未觀察到此類現(xiàn)象，反而在轉(zhuǎn)移性癌癥患者中誘導(dǎo)了腫瘤消退。

總結(jié)
TCR affinity、avidity、共受體以及表位密度之間精妙的相互關(guān)系，突顯了在增強TCR affinity或avidity以感知低表位密度與避免潛在危險的交叉反應(yīng)性之間取得平衡的重要性。為此，開發(fā)具有精細調(diào)控親和力的TCR新方法、從頭生成腫瘤特異性TCR，以及選擇新抗原或TAP非依賴性抗原作為腫瘤靶向的表位，將有助于制備更有效且更安全的TCR修飾T細胞。TCR療法的未來正逐步突破傳統(tǒng)T細胞的局限，非傳統(tǒng)淋巴細胞如γδ T細胞及其TCR，以及NK細胞，正在臨床前和臨床研究中被廣泛探索。這些細胞類型可規(guī)避TCR錯配和交叉反應(yīng)的問題，同時具備內(nèi)在的抗腫瘤活性。由于不會引發(fā)移植物抗宿主并發(fā)癥，它們還為開發(fā)即用型異基因產(chǎn)品提供了可能。此外，聯(lián)合使用細胞因子或免疫檢查點抑制劑以增強T細胞活性的策略，可能減少對構(gòu)建超生理親和力TCR的需求，從而避免嚴重不良反應(yīng)�？傊�，TCR-pMHC相互作用的復(fù)雜性，也即T細胞與腫瘤細胞相互作用的復(fù)雜性，要求TCR基因工程采取整體性策略，以開發(fā)更精準、更有效的過繼性T細胞癌癥療法。