WGBS聯(lián)合分析揭示抑制卵母細(xì)胞CpG高甲基化可保障胚胎正常發(fā)育
近日，瑞士巴塞爾大學(xué)/弗里德里希·米謝爾生物醫(yī)學(xué)研究所Antoine H F M Peters團(tuán)隊(duì)在《Developmental Cell》期刊發(fā)表題為“Preventing CpG hypermethylation in oocytes safeguards mouse development”的研究成果，研究揭示了組蛋白去甲基化酶KDM2A（Lysine Demethylase 2A）和KDM2B在小鼠卵母細(xì)胞中的關(guān)鍵功能，及其通過抑制CpG島（CpG islands, CGIs）的高甲基化以保障胚胎的正常發(fā)育機(jī)制。具體而言，母源缺失KDM2A/KDM2B導(dǎo)致卵母細(xì)胞出現(xiàn)全基因組范圍的H3K36me2沉積，引發(fā)CGIs與基因體（genebody）的異常DNA甲基化，這種異常甲基化在受精后不能被早期胚胎完全重編程，最終通過抑制合子基因組激活（Zygotic Genome Activation, ZGA）導(dǎo)致植入前胚胎死亡。總之，研究通過整合全基因組甲基化測(cè)序（WGBS） 和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（Smart-seq2） 技術(shù)，首次闡明母源表觀基因組穩(wěn)定性對(duì)胚胎發(fā)育的跨代調(diào)控機(jī)制。
標(biāo)題：Preventing CpG hypermethylation in oocytes safeguards mouse development（抑制卵母細(xì)胞中CpG高甲基化保障小鼠正常發(fā)育）
發(fā)表時(shí)間：2025年9月2日
發(fā)表期刊：Developmental Cell（Dev Cell）
技術(shù)平臺(tái)：WGBS、Smart-seq2、CUT&RUN
作者單位：瑞士巴塞爾大學(xué)
DOI:10.1016/j.devcel.2025.08.005
除調(diào)控性CpG島序列外，大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組廣泛存在DNA甲基化。然而在卵母細(xì)胞中，DNA甲基化（DNAme）主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄區(qū)域，抑制卵母細(xì)胞中de novo DNA甲基化的機(jī)制及其對(duì)合子基因組激活（ZGA）和胚胎發(fā)育的相關(guān)性尚不完全清楚。本研究揭示了兩種組蛋白去甲基化酶KDM2A和KDM2B通過抑制H3K36me2的全基因組沉積，從而抑制DNMT3A催化的DNA甲基化。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Kdm2a/Kdm2b雙突變卵母細(xì)胞的CpG島異常DNA甲基化會(huì)介導(dǎo)胚胎2細(xì)胞期的基因轉(zhuǎn)錄抑制。異常母源DNA甲基化會(huì)損害植入前胚胎發(fā)育，其通過在卵子發(fā)生過程中Dnmt3a缺失得以抑制，因此KDM2A/KDM2B對(duì)于抑制卵母細(xì)胞甲基化至關(guān)重要，進(jìn)而賦予早期胚胎發(fā)育能力。本研究結(jié)果表明，早期胚胎的重編程能力不足以清除母源染色質(zhì)上的異常DNA甲基化，且早期發(fā)育容易受到基因劑量單倍體不足效應(yīng)影響，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)育障礙。
結(jié)果圖形
（1）卵母細(xì)胞中的Kdm2a/Kdm2b具有調(diào)控胚胎發(fā)育功能
Kdm2a和Kdm2b在卵母細(xì)胞中高表達(dá)，且在早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。Kdm2a/Kdm2b雙敲除（double-mutant, dKO）的卵母細(xì)胞在發(fā)育過程中表現(xiàn)出嚴(yán)重的胚胎發(fā)育障礙，尤其是在囊胚階段。表明KDM2A和KDM2B在卵母細(xì)胞中具有抑制DNA甲基化和保障胚胎正常發(fā)育的關(guān)鍵作用。
(B) 對(duì)照、單突變和雙/復(fù)合突變的體外胚胎發(fā)育的早期胚胎在指定天數(shù)的發(fā)育進(jìn)展率。
(C–E) 對(duì)GOs（KDM2A）或FGOs（其他）的指定基因型進(jìn)行KDM2A、細(xì)胞質(zhì)KDM2B、H2AK119u1和H3K27me3的免疫熒光染色及定量分析。
（2）KDM2A/KDM2B調(diào)控PRC1介導(dǎo)的基因抑制
通過組蛋白修飾CUT&RUN分析發(fā)現(xiàn)，雙敲除卵母細(xì)胞的H2AK119單泛素化（H2AK119u1）和H3K27三甲基化（H3K27me3）水平顯著下降（圖1D-E）。RNA-seq顯示PRC1靶基因（如轉(zhuǎn)錄因子Pax、Tbx家族）在dKO卵母細(xì)胞中被激活（圖2A）。這些基因在野生型中被H2AK119u1標(biāo)記，而在突變體中解除抑制，表明KDM2A/B通過維持PRC1活性實(shí)現(xiàn)表觀沉默。
圖2. KDM2A/KDM2B在卵母細(xì)胞發(fā)生過程中調(diào)控H2AK119u1沉積和基因表達(dá)
(A) MA圖顯示指定突變FGOs相對(duì)于對(duì)照FGOs的差異表達(dá)。
(B) 維恩圖顯示指定突變FGOs相對(duì)于對(duì)照FGOs上調(diào)基因的數(shù)量。
(C) 散點(diǎn)圖顯示指定突變FGOs相對(duì)于對(duì)照FGOs的表達(dá)log2FC及之間的關(guān)系。
(D) 熱圖顯示CGI啟動(dòng)子基因（上下游±5kb、TSS、基因體、TES）的序列組成、轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)變量，通過k-means聚類將這些基因分為8個(gè)clusters（簇）。從左到右：每個(gè)cluster的基因數(shù)量；CpG覆蓋率；GC百分比；卵母細(xì)胞特異性正義（綠色）和反義（紅色）轉(zhuǎn)錄本；對(duì)照和突變FGOs中的絕對(duì)RNA；突變FGOs相對(duì)于對(duì)照FGOs的log2FC表達(dá)（delta）；對(duì)照和突變FGOs中的H2AK119u1占據(jù)情況；以及WT GOs和FGOs中的H3K4me3、H3K36me3、H3K27me3和H2AK119u1占據(jù)情況。
(E) 箱形圖（Boxplot）顯示對(duì)照FGOs中每個(gè)基因聚類的RNA表達(dá)水平。
(F) 箱形圖顯示在各種突變FGOs中相對(duì)于相應(yīng)對(duì)照FGOs檢測(cè)的每個(gè)基因聚類的log2FC表達(dá)變化。
（3）KDM2A/KDM2B招募抑制性PRC1到染色質(zhì)上
基因聚類分析揭示PRC1靶標(biāo)（Cluster 1-3基因）在雙敲除（dKO）中顯著去抑制（圖2C）。KDM2B的CxxC結(jié)構(gòu)域缺失導(dǎo)致其無法結(jié)合CGIs，致PRC1無法定位于染色質(zhì)，證實(shí)二者通過物理互作招募抑制性復(fù)合體——變異型PRC1.1（vPRC1.1）。
（4）KDM2A/KDM2B限制基因上的H3K36me2沉積和DNA甲基化
KDM2A和KDM2B通過其JmjC結(jié)構(gòu)域去甲基化H3K36me2，從而限制DNMT3A在基因中的DNA甲基化。在Kdm2a/Kdm2b雙敲除（dKO）的卵母細(xì)胞中，H3K36me2和DNA甲基化水平顯著增加（圖3A），WGBS顯示基因組平均CpG甲基化率從正常35.8%增加至58.8%（圖3B），Hox基因等發(fā)育基因出現(xiàn)基因體異常甲基化（圖3E）。表明KDM2A和KDM2B在限制DNA甲基化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。關(guān)鍵驗(yàn)證：敲除Dnmt3a可完全挽救雙突胚胎致死（圖6B），證明DNA甲基化是致死主因。
(B) 2D密度圖顯示突變FGOs與對(duì)照FGOs中CpGs的平均甲基化水平（mCpG/CpG百分比）分布。
(C) 小提琴圖展示指定基因型FGOs中不同基因組元件的mCpG/CpG（%）值的分布。
(D) 熱圖顯示之前在圖2D中描述的8個(gè)CGI啟動(dòng)子基因聚類的序列組成和染色質(zhì)變量。從左到右依次為：CpG覆蓋率；GC百分比；指定基因型FGOs中的H3K36me2、H3K36me3和DNA甲基化；突變FGOs與對(duì)照FGOs中CGI啟動(dòng)子的差異DNA甲基化。
(E) Hoxa-Evx1基因聚類的基因組快照，展示突變FGOs與對(duì)照FGOs相比，CGI啟動(dòng)子（橙色）和基因體中DNA甲基化和H3K36me2的增加情況。
(F) 箱形圖展示在Kdm2aKOKdm2bKO FGOs與對(duì)照FGOs相比，被分配到表達(dá)上調(diào)、下調(diào)、未改變或未檢測(cè)到的基因聚類CGI啟動(dòng)子(-1,500/+500 bps的TSS)或基因體(+500bps的TSS到TES)的差異H3K36me2、DNA甲基化和H3K36me3。
(G) 箱形圖展示在Kdm2aKOKdm2bKO和Kdm2aKOKdm2bΔCxxC FGOs與對(duì)照FGOs相比，8個(gè)CGI啟動(dòng)子基因聚類的所有基因啟動(dòng)子上的差異H3K36me2和DNA甲基化。
（5）KDM2A/KDM2B調(diào)控在CGI啟動(dòng)子上的H3K36me2沉積和DNA甲基化
在Kdm2a/Kdm2b雙敲除的卵母細(xì)胞中，CGI啟動(dòng)子上的H3K36me2和DNA甲基化水平顯著增加（圖3D），CGI高甲基化與H3K36me2沉積同步發(fā)生（圖3F）。表明KDM2A/KDM2B在限制CGI啟動(dòng)子上的DNA甲基化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
（6）KDM2A/KDM2B在全基因組范圍內(nèi)抑制H3K36me2沉積和DNA甲基化
基于H3K4me3、H3K36me3、H3K27me3和H2AK119u1在WT FGOs中的占據(jù)情況，分析了突變FGOs與對(duì)照FGOs中H3K36me2、H3K36me3和DNA甲基化水平的變化（圖4A）。分析結(jié)果表明，KDM2A/KDM2B蛋白在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中維持低水平H3K36me2的作用不僅限于CGI，還具有顯著的全基因組效應(yīng)（圖4B-4D）。在卵母細(xì)胞生長過程中，H3K36me2廣泛沉積與轉(zhuǎn)錄無關(guān)，且這種沉積能被KDM2A/KDM2B蛋白有效抑制。
(B–D) 基因組區(qū)間15,42,43的快照展示在對(duì)照FGOs中標(biāo)記有H2AK119u1和H3K27me3的大基因間區(qū)域，在Kdm2aKOKdm2bKO FGOs中H3K36me2和DNA甲基化的增加。
（7）生長期卵母細(xì)胞（GOs）中的H3K4me3抑制異常DNA甲基化
機(jī)制回歸模型證明低H3K4me3是GOs中異常甲基化的主要"許可因子"（圖5A）。該機(jī)制獨(dú)立于PRC1通路——即使非PRC1靶基因啟動(dòng)子（如代謝基因Gldc），只要H3K4me3缺失即易受甲基化侵襲。
(A) 散點(diǎn)圖顯示在對(duì)照和野生(WT)型FGOs中，啟動(dòng)子和基因內(nèi)CGI的H3K36me2和H3K4me3占據(jù)與DNA甲基化（%）之間的相關(guān)性。
(B) 散點(diǎn)圖顯示在Kdm2aKOKdm2bKO與對(duì)照FGOs之間，啟動(dòng)子和基因內(nèi)CGI的差異DNA甲基化（%）與Kdm2aKOKdm2bKO FGOs中H3K36me2的占據(jù)以及野生型GOs中H3K4me3的占據(jù)之間的關(guān)系。
(C) 條形圖顯示可預(yù)測(cè)Kdm2aKOKdm2bKO與對(duì)照FGOs中CGIs處差異H3K36me2占據(jù)的染色質(zhì)標(biāo)記、基因組位置和三核苷酸序列的線性回歸系數(shù)。
(D) 箱形圖表示在GOs中具有低或高H2AK119u1水平的H3K4me3占據(jù)區(qū)域，CGI中心周圍533bp區(qū)域每100bp的CCG/CGG三核苷酸頻率以及在對(duì)照和Kdm2aKOKdm2bKO FGOs中H3K36me2的富集。
(E) Cartoon圖說明DNA序列、組蛋白修飾酶和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在調(diào)節(jié)H3K36二/三甲基化和de novo DNA甲基化之間的依賴關(guān)系。
（8）組合序列和染色質(zhì)特征定義CGI的異常H3K36me2沉積
CGI上的異常H3K36me2沉積與H2AK119u1和H3K27me3的水平相關(guān)，且受到H3K4me3的抑制。在Kdm2a/Kdm2b雙敲除的卵母細(xì)胞中，CGI上的H3K36me2水平顯著增加，且與H3K4me3水平較低的CGI啟動(dòng)子相關(guān)（圖5C），表明組合序列和染色質(zhì)特征在定義CGI上的異常H3K36me2沉積中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
（9）異常母源DNA甲基化損害植入前發(fā)育
作者研究了Kdm2a/Kdm2b突變卵母細(xì)胞中增加的DNA甲基化對(duì)胚胎發(fā)育的影響。研究發(fā)現(xiàn)，這些突變導(dǎo)致的異常甲基化在受精后并未被重編程，影響了胚胎的早期發(fā)育。通過條件性突變Dnmt3a功能，作者發(fā)現(xiàn)母源Dnmt3a缺失可以完全抑制由Kdm2a/Kdm2b突變引起的胚胎致死，而DNMT1酶缺失則沒有這種效果。這表明KDM2A和KDM2B在卵母細(xì)胞中的一個(gè)重要功能是通過抑制H3K36me2沉積以抑制DNMT3A功能和de novo DNA甲基化。
(B) 對(duì)照和三重突變的植入前胚胎在體外胚胎發(fā)育指定天數(shù)的發(fā)育進(jìn)展。
(C) 匯總表總結(jié)具有指定基因型的胚胎的植入后發(fā)育情況。
(D) MA圖顯示母源突變與相應(yīng)對(duì)照胚胎2細(xì)胞期相比的差異表達(dá)。
(E) 左側(cè)：散點(diǎn)圖顯示Kdm2amatKOKdm2bmatKO與對(duì)照胚胎2細(xì)胞期相比的log2FC表達(dá)量及Kdm2aKOKdm2bKO與對(duì)照FGOs log2FC表達(dá)量之間的關(guān)系，靶向CGI和非CGI啟動(dòng)子相關(guān)基因的親本特異性表達(dá)。右側(cè)：與左側(cè)相同的數(shù)據(jù)，但靶向Kdm2amatKOKdm2bmatΔCxxC 與對(duì)照胚胎2細(xì)胞期相比以及Kdm2aKOKdm2bΔCxxC與對(duì)照FGOs的比較。Kdm2aKOKdm2bKO與對(duì)照FGOs相比的啟動(dòng)子差異甲基化（%）用顏色區(qū)分。
（10）母源Kdm2a/Kdm2b雙敲除會(huì)損害植入后發(fā)育
在Kdm2a/Kdm2b雙敲除的卵母細(xì)胞中，異常DNA甲基化在植入后發(fā)育中得以維持，并損害胚胎發(fā)育。在Kdm2a/Kdm2b雙敲除的e9.5胚胎中，發(fā)育遲緩的胚胎數(shù)量顯著增加（圖6C），此階段致死與Dnmt3a缺失致死表型分離，提示KDM2A/B另有非甲基化相關(guān)功能。
（11）異常DNA甲基化抑制卵母細(xì)胞中的基因表達(dá)
為評(píng)估母源Kdm2a/Kdm2b缺失對(duì)胚胎基因調(diào)控的影響，研究人員對(duì)JF1/Ms雄性小鼠與Kdm2amatKOKdm2bmatKO 雌性小鼠的胚胎2細(xì)胞期進(jìn)行差異表達(dá)分析。結(jié)果顯示數(shù)百個(gè)基因表達(dá)失調(diào)，且存在明顯的等位基因特異性反應(yīng)。母源等位基因在卵母細(xì)胞和胚胎2細(xì)胞期中的差異表達(dá)呈正相關(guān)，而父源等位基因則無此關(guān)聯(lián)。值得注意的是，雙突變胚胎2細(xì)胞期中36%表達(dá)下調(diào)的母源CGI啟動(dòng)子基因，在Kdm2aKOKdm2bKO卵母細(xì)胞啟動(dòng)子區(qū)呈現(xiàn)高甲基化（>50%）。但矛盾的是，部分甲基化CGI基因在突變卵母細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。
在 Kdm2amatKOKdm2bmatΔCxxC 和單突變Kdm2bmatΔCxxC 樣本中也觀察到類似的轉(zhuǎn)錄和甲基化反應(yīng)。
為深入探究異常DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄組間的機(jī)制關(guān)系，研究人員根據(jù)ctrl、三突變卵母細(xì)胞和野生型精子中CGI啟動(dòng)子的DNA甲基化狀態(tài)，將其分為7個(gè)clusters。cluster1-4中近1500個(gè)CGI啟動(dòng)子在突變卵母細(xì)胞中出現(xiàn)廣泛異常甲基化；cluster 5中超1250個(gè)CGI啟動(dòng)子在Kdm2aKOKdm2bKO卵母細(xì)胞中呈現(xiàn)中度異常甲基化。GO分析表明，cluster 1-5的許多基因在發(fā)育中起重要作用，且多為PRC1靶基因。cluster 6的CGI在對(duì)照和突變卵母細(xì)胞中均高甲基化，可能位于卵母細(xì)胞特異性上游啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的基因體內(nèi)。cluster 7的CGI在任何基因型中基本未甲基化或低甲基化。成熟精子中無明顯CGI甲基化。
進(jìn)一步分析異常CGI啟動(dòng)子DNA甲基化與基因表達(dá)變化的關(guān)系。在卵母細(xì)胞中，上調(diào)和下調(diào)基因在各cluster分布較均勻，但cluster 2-4中表達(dá)下調(diào)的基因與異常DNA甲基化顯著相關(guān)，可能是異常DNA甲基化直接抑制了CGI啟動(dòng)子。而cluster 2-5中其他UCSC注釋的CGI異常甲基化與雙突變卵母細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的基因相關(guān)，但在突變胚胎中無此現(xiàn)象。cluster 6的CGI甲基化增加可能與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)過程有關(guān)，這些CGI位于通常受PRC1抑制的卵母細(xì)胞特異性上游啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的基因組區(qū)域內(nèi)，其異常轉(zhuǎn)錄本在CGI上下游均升高。研究揭示了母源Kdm2a/Kdm2b缺失通過影響CGI啟動(dòng)子DNA甲基化狀態(tài)，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)。
(A) 熱圖顯示根據(jù)UCSC數(shù)據(jù)庫的CGI啟動(dòng)子在對(duì)照和突變FGOs以及WT精子中的絕對(duì)啟動(dòng)子甲基化水平進(jìn)行聚類結(jié)果。
(B) 與(A)中DNA甲基化clusters1-5相關(guān)的CGI基因的富集程度和統(tǒng)計(jì)顯著性水平GO富集分析。
(C) 在Kdm2aKOKdm2bKO與對(duì)照FGOs以及在Kdm2amatKOKdm2bmatKO 與對(duì)照胚胎2細(xì)胞期中，CGI啟動(dòng)子基因和所有非CGI啟動(dòng)子基因的log2FC表達(dá)。
(D) 條形圖顯示在DNA甲基化clusters中，CGI啟動(dòng)子基因的過/低表達(dá)情況以及它們?cè)贙dm2aKOKdm2bKO與對(duì)照FGOs或在Kdm2amatKOKdm2bmatKO 與對(duì)照胚胎2細(xì)胞期中的顯著上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的統(tǒng)計(jì)顯著性。
(E) 條形圖顯示在用RNA聚合酶II和III的抑制劑α-鵝膏蕈堿處理的胚胎2細(xì)胞期中，顯著上調(diào)或下調(diào)的DNA甲基化clusters中的CGI啟動(dòng)子基因的過/低表達(dá)情況和統(tǒng)計(jì)顯著性。
(F) 熱圖顯示了根據(jù)UCSC數(shù)據(jù)庫的CGI啟動(dòng)子在對(duì)照和Kdm2aKOKdm2bKO FGOs以及對(duì)照和Kdm2amatKOKdm2bmatKO 胚胎4細(xì)胞期中母源和父源基因組的絕對(duì)啟動(dòng)子DNA甲基化水平進(jìn)行聚類。Mat-和pat-hypo指的是在對(duì)照胚胎中發(fā)生de novo甲基化的CGI。
(G) 在Kdm2amatKOKdm2bmatKO 與對(duì)照胚胎2細(xì)胞期中，根據(jù)親本特異性測(cè)序讀數(shù)，(F)中所示的不同CGI和非CGI啟動(dòng)子基因簇的log2FC表達(dá)。
(H) 根據(jù)親本特異性測(cè)序讀數(shù)，在Kdm2amatKOKdm2bmatKO 與對(duì)照胚胎2細(xì)胞期中，根據(jù)(F)定義的DNA甲基化clusters中的CGI啟動(dòng)子基因的過/低表達(dá)情況及其顯著上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的統(tǒng)計(jì)顯著性。
(I) Gldc、Eomes和Hes2基因的基因組快照顯示在卵母細(xì)胞和胚胎4細(xì)胞期中CGI啟動(dòng)子（橙色）的異常DNA甲基化。
（12）異常DNA甲基化與胚胎2細(xì)胞期的母源基因抑制相關(guān)
在Kdm2a/Kdm2b雙敲除的胚胎2細(xì)胞期胎中，異常DNA甲基化與母源基因抑制相關(guān)。通過雜交品系（C57/JF1）等位分析顯示，dKO來源的胚胎2細(xì)胞期中，高甲基化基因的母源拷貝特異性沉默。父源拷貝表達(dá)正常，提示"基因劑量不足"是致死機(jī)制。
（13）母源異常DNA甲基化在胚胎4細(xì)胞期中得以維持
在Kdm2a/Kdm2b雙敲除的胚胎4細(xì)胞期中，異常DNA甲基化得以維持。卵母細(xì)胞甲基化在胚胎4細(xì)胞期未按預(yù)期"稀釋"（圖7F）。333/479高甲基化CGI維持>75%甲基化水平，遠(yuǎn)超復(fù)制稀釋效應(yīng)（理論應(yīng)降至25%-50%），證明主動(dòng)維持機(jī)制介入。
（14）高甲基化影響關(guān)鍵發(fā)育調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)子
在Kdm2a/Kdm2b雙敲除的卵母細(xì)胞中，許多關(guān)鍵發(fā)育調(diào)節(jié)基因的啟動(dòng)子發(fā)生高甲基化。GO分析顯示高甲基化基因富集在發(fā)育關(guān)鍵通路：Bmp4、Wnt2基因介導(dǎo)；Sox17、Gata4基因介導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)決定，Gldc介導(dǎo)代謝調(diào)控，其中Hes2等基因同時(shí)受甲基化抑制，其功能缺失直接導(dǎo)致胚胎停滯。
結(jié)論和啟示
本研究揭示了KDM2A和KDM2B在卵母細(xì)胞中的關(guān)鍵作用，強(qiáng)調(diào)了其在抑制DNA甲基化和維持胚胎正常發(fā)育中的重要性。KDM2A和KDM2B通過H3K36me2去甲基化，抑制了DNMT3A在卵母細(xì)胞中建立全局DNA甲基化的能力。此外，KDM2A和KDM2B通過其CxxC結(jié)構(gòu)域招募PRC1復(fù)合體到CGI啟動(dòng)子上，從而抑制基因表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)不僅加強(qiáng)了對(duì)卵母細(xì)胞基因組甲基化調(diào)控機(jī)制的理解，還為研究胚胎發(fā)育過程中的表觀遺傳調(diào)控提供了新視角。此外，該研究應(yīng)用WGBS和Smart-seq2技術(shù)在解析基因組甲基化和基因表達(dá)調(diào)控，為未來類似研究提供了關(guān)鍵技術(shù)參考。
參考文獻(xiàn)：
Kawamura YK, Ozonov EA, Papasaikas P, Kondo T, Nguyen NV, Stadler MB, Smallwood SA, Koseki H, Peters AHFM. Preventing CpG hypermethylation in oocytes safeguards mouse development. Dev Cell. 2025 Aug 29. doi: 10.1016/j.devcel.2025.08.005.
標(biāo)題：Preventing CpG hypermethylation in oocytes safeguards mouse development（抑制卵母細(xì)胞中CpG高甲基化保障小鼠正常發(fā)育）
發(fā)表時(shí)間：2025年9月2日
發(fā)表期刊：Developmental Cell（Dev Cell）
技術(shù)平臺(tái)：WGBS、Smart-seq2、CUT&RUN
作者單位：瑞士巴塞爾大學(xué)
DOI:10.1016/j.devcel.2025.08.005
除調(diào)控性CpG島序列外，大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組廣泛存在DNA甲基化。然而在卵母細(xì)胞中，DNA甲基化（DNAme）主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄區(qū)域，抑制卵母細(xì)胞中de novo DNA甲基化的機(jī)制及其對(duì)合子基因組激活（ZGA）和胚胎發(fā)育的相關(guān)性尚不完全清楚。本研究揭示了兩種組蛋白去甲基化酶KDM2A和KDM2B通過抑制H3K36me2的全基因組沉積，從而抑制DNMT3A催化的DNA甲基化。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Kdm2a/Kdm2b雙突變卵母細(xì)胞的CpG島異常DNA甲基化會(huì)介導(dǎo)胚胎2細(xì)胞期的基因轉(zhuǎn)錄抑制。異常母源DNA甲基化會(huì)損害植入前胚胎發(fā)育，其通過在卵子發(fā)生過程中Dnmt3a缺失得以抑制，因此KDM2A/KDM2B對(duì)于抑制卵母細(xì)胞甲基化至關(guān)重要，進(jìn)而賦予早期胚胎發(fā)育能力。本研究結(jié)果表明，早期胚胎的重編程能力不足以清除母源染色質(zhì)上的異常DNA甲基化，且早期發(fā)育容易受到基因劑量單倍體不足效應(yīng)影響，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)育障礙。
- KDM2A/KDM2B通過去甲基化H3K36me2以抑制小鼠卵母細(xì)胞中de novo DNA甲基化。
- DNA序列和H3K4me3調(diào)控CGIs中的異常H3K36me2和DNA甲基化。
- 異常卵母細(xì)胞DNA甲基化在早期胚胎中不會(huì)被重編程，并抑制轉(zhuǎn)錄。
- 異常卵母細(xì)胞DNA甲基化的代際遺傳對(duì)早期胚胎具有致死性。
研究摘要
研究方法
- 基因敲除小鼠模型的構(gòu)建：通過Zp3-cre轉(zhuǎn)基因小鼠，研究人員在卵母細(xì)胞中特異性敲除Kdm2a和Kdm2b基因，構(gòu)建了Kdm2a/Kdm2b雙敲除小鼠模型。
- 卵母細(xì)胞和胚胎的收集：從不同日齡的小鼠中收集生長期卵母細(xì)胞（GOs）和完全成熟卵母細(xì)胞（FGOs），并進(jìn)行體外受精（IVF）以同步化受精時(shí)間。
- 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（Smart-seq2）：對(duì)單個(gè)卵母細(xì)胞和胚胎進(jìn)行Smart-seq2測(cè)序，以分析基因表達(dá)變化。
- 全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）：對(duì)卵母細(xì)胞和胚胎4細(xì)胞期進(jìn)行WGBS，以分析DNA甲基化狀態(tài)。
- 染色質(zhì)免疫沉淀（CUT&RUN）：對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行CUT&RUN實(shí)驗(yàn)，以分析組蛋白修飾狀態(tài)。
- 免疫熒光染色：對(duì)卵母細(xì)胞和胚胎進(jìn)行免疫熒光染色，以檢測(cè)特定組蛋白修飾和DNA甲基化的分布。
- 甲基化-轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析：WGBS與Smart-seq2整合，鑒定因啟動(dòng)子高甲基化被抑制的ZGA基因。
結(jié)果圖形
（1）卵母細(xì)胞中的Kdm2a/Kdm2b具有調(diào)控胚胎發(fā)育功能
Kdm2a和Kdm2b在卵母細(xì)胞中高表達(dá)，且在早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。Kdm2a/Kdm2b雙敲除（double-mutant, dKO）的卵母細(xì)胞在發(fā)育過程中表現(xiàn)出嚴(yán)重的胚胎發(fā)育障礙，尤其是在囊胚階段。表明KDM2A和KDM2B在卵母細(xì)胞中具有抑制DNA甲基化和保障胚胎正常發(fā)育的關(guān)鍵作用。
圖1：KDM2A和KDM2B在卵母細(xì)胞中調(diào)控胚胎發(fā)育
(A) 對(duì)照（ctrl）和突變條件下卵母細(xì)胞中表達(dá)的Kdm2a和Kdm2b基因示意圖。(B) 對(duì)照、單突變和雙/復(fù)合突變的體外胚胎發(fā)育的早期胚胎在指定天數(shù)的發(fā)育進(jìn)展率。
(C–E) 對(duì)GOs（KDM2A）或FGOs（其他）的指定基因型進(jìn)行KDM2A、細(xì)胞質(zhì)KDM2B、H2AK119u1和H3K27me3的免疫熒光染色及定量分析。
（2）KDM2A/KDM2B調(diào)控PRC1介導(dǎo)的基因抑制
通過組蛋白修飾CUT&RUN分析發(fā)現(xiàn)，雙敲除卵母細(xì)胞的H2AK119單泛素化（H2AK119u1）和H3K27三甲基化（H3K27me3）水平顯著下降（圖1D-E）。RNA-seq顯示PRC1靶基因（如轉(zhuǎn)錄因子Pax、Tbx家族）在dKO卵母細(xì)胞中被激活（圖2A）。這些基因在野生型中被H2AK119u1標(biāo)記，而在突變體中解除抑制，表明KDM2A/B通過維持PRC1活性實(shí)現(xiàn)表觀沉默。
圖2. KDM2A/KDM2B在卵母細(xì)胞發(fā)生過程中調(diào)控H2AK119u1沉積和基因表達(dá)
(B) 維恩圖顯示指定突變FGOs相對(duì)于對(duì)照FGOs上調(diào)基因的數(shù)量。
(C) 散點(diǎn)圖顯示指定突變FGOs相對(duì)于對(duì)照FGOs的表達(dá)log2FC及之間的關(guān)系。
(D) 熱圖顯示CGI啟動(dòng)子基因（上下游±5kb、TSS、基因體、TES）的序列組成、轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)變量，通過k-means聚類將這些基因分為8個(gè)clusters（簇）。從左到右：每個(gè)cluster的基因數(shù)量；CpG覆蓋率；GC百分比；卵母細(xì)胞特異性正義（綠色）和反義（紅色）轉(zhuǎn)錄本；對(duì)照和突變FGOs中的絕對(duì)RNA；突變FGOs相對(duì)于對(duì)照FGOs的log2FC表達(dá)（delta）；對(duì)照和突變FGOs中的H2AK119u1占據(jù)情況；以及WT GOs和FGOs中的H3K4me3、H3K36me3、H3K27me3和H2AK119u1占據(jù)情況。
(E) 箱形圖（Boxplot）顯示對(duì)照FGOs中每個(gè)基因聚類的RNA表達(dá)水平。
(F) 箱形圖顯示在各種突變FGOs中相對(duì)于相應(yīng)對(duì)照FGOs檢測(cè)的每個(gè)基因聚類的log2FC表達(dá)變化。
（3）KDM2A/KDM2B招募抑制性PRC1到染色質(zhì)上
基因聚類分析揭示PRC1靶標(biāo)（Cluster 1-3基因）在雙敲除（dKO）中顯著去抑制（圖2C）。KDM2B的CxxC結(jié)構(gòu)域缺失導(dǎo)致其無法結(jié)合CGIs，致PRC1無法定位于染色質(zhì)，證實(shí)二者通過物理互作招募抑制性復(fù)合體——變異型PRC1.1（vPRC1.1）。
（4）KDM2A/KDM2B限制基因上的H3K36me2沉積和DNA甲基化
KDM2A和KDM2B通過其JmjC結(jié)構(gòu)域去甲基化H3K36me2，從而限制DNMT3A在基因中的DNA甲基化。在Kdm2a/Kdm2b雙敲除（dKO）的卵母細(xì)胞中，H3K36me2和DNA甲基化水平顯著增加（圖3A），WGBS顯示基因組平均CpG甲基化率從正常35.8%增加至58.8%（圖3B），Hox基因等發(fā)育基因出現(xiàn)基因體異常甲基化（圖3E）。表明KDM2A和KDM2B在限制DNA甲基化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。關(guān)鍵驗(yàn)證：敲除Dnmt3a可完全挽救雙突胚胎致死（圖6B），證明DNA甲基化是致死主因。
圖3. KDM2A/KDM2B限制卵母細(xì)胞中H3K36me2和DNA甲基化在啟動(dòng)子和基因上的沉積
(A) 對(duì)指定突變和相應(yīng)對(duì)照基因型的GOs進(jìn)行H3K36me2和H3K36me3的免疫熒光染色和定量分析，以及對(duì)FGOs進(jìn)行5mC的免疫熒光染色分析。(B) 2D密度圖顯示突變FGOs與對(duì)照FGOs中CpGs的平均甲基化水平（mCpG/CpG百分比）分布。
(C) 小提琴圖展示指定基因型FGOs中不同基因組元件的mCpG/CpG（%）值的分布。
(D) 熱圖顯示之前在圖2D中描述的8個(gè)CGI啟動(dòng)子基因聚類的序列組成和染色質(zhì)變量。從左到右依次為：CpG覆蓋率；GC百分比；指定基因型FGOs中的H3K36me2、H3K36me3和DNA甲基化；突變FGOs與對(duì)照FGOs中CGI啟動(dòng)子的差異DNA甲基化。
(E) Hoxa-Evx1基因聚類的基因組快照，展示突變FGOs與對(duì)照FGOs相比，CGI啟動(dòng)子（橙色）和基因體中DNA甲基化和H3K36me2的增加情況。
(F) 箱形圖展示在Kdm2aKOKdm2bKO FGOs與對(duì)照FGOs相比，被分配到表達(dá)上調(diào)、下調(diào)、未改變或未檢測(cè)到的基因聚類CGI啟動(dòng)子(-1,500/+500 bps的TSS)或基因體(+500bps的TSS到TES)的差異H3K36me2、DNA甲基化和H3K36me3。
(G) 箱形圖展示在Kdm2aKOKdm2bKO和Kdm2aKOKdm2bΔCxxC FGOs與對(duì)照FGOs相比，8個(gè)CGI啟動(dòng)子基因聚類的所有基因啟動(dòng)子上的差異H3K36me2和DNA甲基化。
（5）KDM2A/KDM2B調(diào)控在CGI啟動(dòng)子上的H3K36me2沉積和DNA甲基化
在Kdm2a/Kdm2b雙敲除的卵母細(xì)胞中，CGI啟動(dòng)子上的H3K36me2和DNA甲基化水平顯著增加（圖3D），CGI高甲基化與H3K36me2沉積同步發(fā)生（圖3F）。表明KDM2A/KDM2B在限制CGI啟動(dòng)子上的DNA甲基化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
（6）KDM2A/KDM2B在全基因組范圍內(nèi)抑制H3K36me2沉積和DNA甲基化
基于H3K4me3、H3K36me3、H3K27me3和H2AK119u1在WT FGOs中的占據(jù)情況，分析了突變FGOs與對(duì)照FGOs中H3K36me2、H3K36me3和DNA甲基化水平的變化（圖4A）。分析結(jié)果表明，KDM2A/KDM2B蛋白在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中維持低水平H3K36me2的作用不僅限于CGI，還具有顯著的全基因組效應(yīng)（圖4B-4D）。在卵母細(xì)胞生長過程中，H3K36me2廣泛沉積與轉(zhuǎn)錄無關(guān)，且這種沉積能被KDM2A/KDM2B蛋白有效抑制。
圖4：在Kdm2a/Kdm2b缺失的卵母細(xì)胞中，H3K36me2和DNA甲基化的沉積與轉(zhuǎn)錄無關(guān)
(A) 熱圖展示卵母細(xì)胞中10kb基因間區(qū)的8個(gè)clusters內(nèi)的染色質(zhì)和轉(zhuǎn)錄變量。數(shù)據(jù)以20個(gè)相鄰的500bp bins顯示。從左到右依次為：每個(gè)cluster的區(qū)域數(shù)量；CpG覆蓋率；GC百分比；對(duì)照和突變FGOs中的H2AK119u1、H3K36me2和DNA甲基化；在20kb側(cè)翼區(qū)域內(nèi)存在注釋的TTS；在第9天和第14天的GOs中，指定突變和對(duì)照基因型之間的表達(dá)log2FC；在隨機(jī)引物（總）第14天的GOs和FGOs中。RNA表達(dá)數(shù)據(jù)基于poly(A)引物RNA捕獲和Smart-seq2文庫生成。(B–D) 基因組區(qū)間15,42,43的快照展示在對(duì)照FGOs中標(biāo)記有H2AK119u1和H3K27me3的大基因間區(qū)域，在Kdm2aKOKdm2bKO FGOs中H3K36me2和DNA甲基化的增加。
（7）生長期卵母細(xì)胞（GOs）中的H3K4me3抑制異常DNA甲基化
機(jī)制回歸模型證明低H3K4me3是GOs中異常甲基化的主要"許可因子"（圖5A）。該機(jī)制獨(dú)立于PRC1通路——即使非PRC1靶基因啟動(dòng)子（如代謝基因Gldc），只要H3K4me3缺失即易受甲基化侵襲。
圖5：GOs中低水平的H3K4me3允許在卵母細(xì)胞生長期間獲得H3K36me2和DNA甲基化
(A) 散點(diǎn)圖顯示在對(duì)照和野生(WT)型FGOs中，啟動(dòng)子和基因內(nèi)CGI的H3K36me2和H3K4me3占據(jù)與DNA甲基化（%）之間的相關(guān)性。
(B) 散點(diǎn)圖顯示在Kdm2aKOKdm2bKO與對(duì)照FGOs之間，啟動(dòng)子和基因內(nèi)CGI的差異DNA甲基化（%）與Kdm2aKOKdm2bKO FGOs中H3K36me2的占據(jù)以及野生型GOs中H3K4me3的占據(jù)之間的關(guān)系。
(C) 條形圖顯示可預(yù)測(cè)Kdm2aKOKdm2bKO與對(duì)照FGOs中CGIs處差異H3K36me2占據(jù)的染色質(zhì)標(biāo)記、基因組位置和三核苷酸序列的線性回歸系數(shù)。
(D) 箱形圖表示在GOs中具有低或高H2AK119u1水平的H3K4me3占據(jù)區(qū)域，CGI中心周圍533bp區(qū)域每100bp的CCG/CGG三核苷酸頻率以及在對(duì)照和Kdm2aKOKdm2bKO FGOs中H3K36me2的富集。
(E) Cartoon圖說明DNA序列、組蛋白修飾酶和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在調(diào)節(jié)H3K36二/三甲基化和de novo DNA甲基化之間的依賴關(guān)系。
（8）組合序列和染色質(zhì)特征定義CGI的異常H3K36me2沉積
CGI上的異常H3K36me2沉積與H2AK119u1和H3K27me3的水平相關(guān)，且受到H3K4me3的抑制。在Kdm2a/Kdm2b雙敲除的卵母細(xì)胞中，CGI上的H3K36me2水平顯著增加，且與H3K4me3水平較低的CGI啟動(dòng)子相關(guān)（圖5C），表明組合序列和染色質(zhì)特征在定義CGI上的異常H3K36me2沉積中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
（9）異常母源DNA甲基化損害植入前發(fā)育
作者研究了Kdm2a/Kdm2b突變卵母細(xì)胞中增加的DNA甲基化對(duì)胚胎發(fā)育的影響。研究發(fā)現(xiàn)，這些突變導(dǎo)致的異常甲基化在受精后并未被重編程，影響了胚胎的早期發(fā)育。通過條件性突變Dnmt3a功能，作者發(fā)現(xiàn)母源Dnmt3a缺失可以完全抑制由Kdm2a/Kdm2b突變引起的胚胎致死，而DNMT1酶缺失則沒有這種效果。這表明KDM2A和KDM2B在卵母細(xì)胞中的一個(gè)重要功能是通過抑制H3K36me2沉積以抑制DNMT3A功能和de novo DNA甲基化。
圖6. 異常母源DNA甲基化損害植入前發(fā)育
(A) 對(duì)照和突變晚期合子的母源（m）和父源（p）原核進(jìn)行5mC的免疫熒光染色和定量分析。(B) 對(duì)照和三重突變的植入前胚胎在體外胚胎發(fā)育指定天數(shù)的發(fā)育進(jìn)展。
(C) 匯總表總結(jié)具有指定基因型的胚胎的植入后發(fā)育情況。
(D) MA圖顯示母源突變與相應(yīng)對(duì)照胚胎2細(xì)胞期相比的差異表達(dá)。
(E) 左側(cè)：散點(diǎn)圖顯示Kdm2amatKOKdm2bmatKO與對(duì)照胚胎2細(xì)胞期相比的log2FC表達(dá)量及Kdm2aKOKdm2bKO與對(duì)照FGOs log2FC表達(dá)量之間的關(guān)系，靶向CGI和非CGI啟動(dòng)子相關(guān)基因的親本特異性表達(dá)。右側(cè)：與左側(cè)相同的數(shù)據(jù)，但靶向Kdm2amatKOKdm2bmatΔCxxC 與對(duì)照胚胎2細(xì)胞期相比以及Kdm2aKOKdm2bΔCxxC與對(duì)照FGOs的比較。Kdm2aKOKdm2bKO與對(duì)照FGOs相比的啟動(dòng)子差異甲基化（%）用顏色區(qū)分。
（10）母源Kdm2a/Kdm2b雙敲除會(huì)損害植入后發(fā)育
在Kdm2a/Kdm2b雙敲除的卵母細(xì)胞中，異常DNA甲基化在植入后發(fā)育中得以維持，并損害胚胎發(fā)育。在Kdm2a/Kdm2b雙敲除的e9.5胚胎中，發(fā)育遲緩的胚胎數(shù)量顯著增加（圖6C），此階段致死與Dnmt3a缺失致死表型分離，提示KDM2A/B另有非甲基化相關(guān)功能。
（11）異常DNA甲基化抑制卵母細(xì)胞中的基因表達(dá)
為評(píng)估母源Kdm2a/Kdm2b缺失對(duì)胚胎基因調(diào)控的影響，研究人員對(duì)JF1/Ms雄性小鼠與Kdm2amatKOKdm2bmatKO 雌性小鼠的胚胎2細(xì)胞期進(jìn)行差異表達(dá)分析。結(jié)果顯示數(shù)百個(gè)基因表達(dá)失調(diào)，且存在明顯的等位基因特異性反應(yīng)。母源等位基因在卵母細(xì)胞和胚胎2細(xì)胞期中的差異表達(dá)呈正相關(guān)，而父源等位基因則無此關(guān)聯(lián)。值得注意的是，雙突變胚胎2細(xì)胞期中36%表達(dá)下調(diào)的母源CGI啟動(dòng)子基因，在Kdm2aKOKdm2bKO卵母細(xì)胞啟動(dòng)子區(qū)呈現(xiàn)高甲基化（>50%）。但矛盾的是，部分甲基化CGI基因在突變卵母細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。
在 Kdm2amatKOKdm2bmatΔCxxC 和單突變Kdm2bmatΔCxxC 樣本中也觀察到類似的轉(zhuǎn)錄和甲基化反應(yīng)。
為深入探究異常DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄組間的機(jī)制關(guān)系，研究人員根據(jù)ctrl、三突變卵母細(xì)胞和野生型精子中CGI啟動(dòng)子的DNA甲基化狀態(tài)，將其分為7個(gè)clusters。cluster1-4中近1500個(gè)CGI啟動(dòng)子在突變卵母細(xì)胞中出現(xiàn)廣泛異常甲基化；cluster 5中超1250個(gè)CGI啟動(dòng)子在Kdm2aKOKdm2bKO卵母細(xì)胞中呈現(xiàn)中度異常甲基化。GO分析表明，cluster 1-5的許多基因在發(fā)育中起重要作用，且多為PRC1靶基因。cluster 6的CGI在對(duì)照和突變卵母細(xì)胞中均高甲基化，可能位于卵母細(xì)胞特異性上游啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的基因體內(nèi)。cluster 7的CGI在任何基因型中基本未甲基化或低甲基化。成熟精子中無明顯CGI甲基化。
進(jìn)一步分析異常CGI啟動(dòng)子DNA甲基化與基因表達(dá)變化的關(guān)系。在卵母細(xì)胞中，上調(diào)和下調(diào)基因在各cluster分布較均勻，但cluster 2-4中表達(dá)下調(diào)的基因與異常DNA甲基化顯著相關(guān)，可能是異常DNA甲基化直接抑制了CGI啟動(dòng)子。而cluster 2-5中其他UCSC注釋的CGI異常甲基化與雙突變卵母細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的基因相關(guān)，但在突變胚胎中無此現(xiàn)象。cluster 6的CGI甲基化增加可能與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)過程有關(guān)，這些CGI位于通常受PRC1抑制的卵母細(xì)胞特異性上游啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的基因組區(qū)域內(nèi)，其異常轉(zhuǎn)錄本在CGI上下游均升高。研究揭示了母源Kdm2a/Kdm2b缺失通過影響CGI啟動(dòng)子DNA甲基化狀態(tài)，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)。
圖7：被異常母源啟動(dòng)子DNA甲基化標(biāo)記的基因在早期胚胎中受到抑制
(A) 熱圖顯示根據(jù)UCSC數(shù)據(jù)庫的CGI啟動(dòng)子在對(duì)照和突變FGOs以及WT精子中的絕對(duì)啟動(dòng)子甲基化水平進(jìn)行聚類結(jié)果。
(B) 與(A)中DNA甲基化clusters1-5相關(guān)的CGI基因的富集程度和統(tǒng)計(jì)顯著性水平GO富集分析。
(C) 在Kdm2aKOKdm2bKO與對(duì)照FGOs以及在Kdm2amatKOKdm2bmatKO 與對(duì)照胚胎2細(xì)胞期中，CGI啟動(dòng)子基因和所有非CGI啟動(dòng)子基因的log2FC表達(dá)。
(D) 條形圖顯示在DNA甲基化clusters中，CGI啟動(dòng)子基因的過/低表達(dá)情況以及它們?cè)贙dm2aKOKdm2bKO與對(duì)照FGOs或在Kdm2amatKOKdm2bmatKO 與對(duì)照胚胎2細(xì)胞期中的顯著上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的統(tǒng)計(jì)顯著性。
(E) 條形圖顯示在用RNA聚合酶II和III的抑制劑α-鵝膏蕈堿處理的胚胎2細(xì)胞期中，顯著上調(diào)或下調(diào)的DNA甲基化clusters中的CGI啟動(dòng)子基因的過/低表達(dá)情況和統(tǒng)計(jì)顯著性。
(F) 熱圖顯示了根據(jù)UCSC數(shù)據(jù)庫的CGI啟動(dòng)子在對(duì)照和Kdm2aKOKdm2bKO FGOs以及對(duì)照和Kdm2amatKOKdm2bmatKO 胚胎4細(xì)胞期中母源和父源基因組的絕對(duì)啟動(dòng)子DNA甲基化水平進(jìn)行聚類。Mat-和pat-hypo指的是在對(duì)照胚胎中發(fā)生de novo甲基化的CGI。
(G) 在Kdm2amatKOKdm2bmatKO 與對(duì)照胚胎2細(xì)胞期中，根據(jù)親本特異性測(cè)序讀數(shù)，(F)中所示的不同CGI和非CGI啟動(dòng)子基因簇的log2FC表達(dá)。
(H) 根據(jù)親本特異性測(cè)序讀數(shù)，在Kdm2amatKOKdm2bmatKO 與對(duì)照胚胎2細(xì)胞期中，根據(jù)(F)定義的DNA甲基化clusters中的CGI啟動(dòng)子基因的過/低表達(dá)情況及其顯著上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的統(tǒng)計(jì)顯著性。
(I) Gldc、Eomes和Hes2基因的基因組快照顯示在卵母細(xì)胞和胚胎4細(xì)胞期中CGI啟動(dòng)子（橙色）的異常DNA甲基化。
（12）異常DNA甲基化與胚胎2細(xì)胞期的母源基因抑制相關(guān)
在Kdm2a/Kdm2b雙敲除的胚胎2細(xì)胞期胎中，異常DNA甲基化與母源基因抑制相關(guān)。通過雜交品系（C57/JF1）等位分析顯示，dKO來源的胚胎2細(xì)胞期中，高甲基化基因的母源拷貝特異性沉默。父源拷貝表達(dá)正常，提示"基因劑量不足"是致死機(jī)制。
（13）母源異常DNA甲基化在胚胎4細(xì)胞期中得以維持
在Kdm2a/Kdm2b雙敲除的胚胎4細(xì)胞期中，異常DNA甲基化得以維持。卵母細(xì)胞甲基化在胚胎4細(xì)胞期未按預(yù)期"稀釋"（圖7F）。333/479高甲基化CGI維持>75%甲基化水平，遠(yuǎn)超復(fù)制稀釋效應(yīng)（理論應(yīng)降至25%-50%），證明主動(dòng)維持機(jī)制介入。
（14）高甲基化影響關(guān)鍵發(fā)育調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)子
在Kdm2a/Kdm2b雙敲除的卵母細(xì)胞中，許多關(guān)鍵發(fā)育調(diào)節(jié)基因的啟動(dòng)子發(fā)生高甲基化。GO分析顯示高甲基化基因富集在發(fā)育關(guān)鍵通路：Bmp4、Wnt2基因介導(dǎo)；Sox17、Gata4基因介導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)決定，Gldc介導(dǎo)代謝調(diào)控，其中Hes2等基因同時(shí)受甲基化抑制，其功能缺失直接導(dǎo)致胚胎停滯。
結(jié)論和啟示
本研究揭示了KDM2A和KDM2B在卵母細(xì)胞中的關(guān)鍵作用，強(qiáng)調(diào)了其在抑制DNA甲基化和維持胚胎正常發(fā)育中的重要性。KDM2A和KDM2B通過H3K36me2去甲基化，抑制了DNMT3A在卵母細(xì)胞中建立全局DNA甲基化的能力。此外，KDM2A和KDM2B通過其CxxC結(jié)構(gòu)域招募PRC1復(fù)合體到CGI啟動(dòng)子上，從而抑制基因表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)不僅加強(qiáng)了對(duì)卵母細(xì)胞基因組甲基化調(diào)控機(jī)制的理解，還為研究胚胎發(fā)育過程中的表觀遺傳調(diào)控提供了新視角。此外，該研究應(yīng)用WGBS和Smart-seq2技術(shù)在解析基因組甲基化和基因表達(dá)調(diào)控，為未來類似研究提供了關(guān)鍵技術(shù)參考。
參考文獻(xiàn)：
Kawamura YK, Ozonov EA, Papasaikas P, Kondo T, Nguyen NV, Stadler MB, Smallwood SA, Koseki H, Peters AHFM. Preventing CpG hypermethylation in oocytes safeguards mouse development. Dev Cell. 2025 Aug 29. doi: 10.1016/j.devcel.2025.08.005.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
表觀基因組學(xué)
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