高通量RNA測序（RNA-seq）的基礎(chǔ)原理與技術(shù)參數(shù)

瀏覽次數(shù)：296　發(fā)布日期：2025-10-28　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

高通量 RNA 測序（RNA-seq）
1. 核心基礎(chǔ)概念
1.1 轉(zhuǎn)錄組
轉(zhuǎn)錄組是指在特定生理或?qū)嶒?yàn)條件下，單個(gè)細(xì)胞、組織或個(gè)體產(chǎn)生的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合。廣義轉(zhuǎn)錄組涵蓋 mRNA、rRNA、tRNA 及非編碼 RNA；狹義轉(zhuǎn)錄組特指所有 mRNA 的集合，在未額外說明的實(shí)際研究中，轉(zhuǎn)錄組通常默認(rèn)指代 mRNA。轉(zhuǎn)錄組可反映樣本的整體基因表達(dá)水平，因此也被稱為表達(dá)譜，常用基因芯片和 RNA-seq 技術(shù)開展研究。

Q1：廣義轉(zhuǎn)錄組與狹義轉(zhuǎn)錄組的核心區(qū)別是什么？
A1：核心區(qū)別在于包含的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物范圍，廣義轉(zhuǎn)錄組涵蓋 mRNA、rRNA、tRNA 及非編碼 RNA，狹義轉(zhuǎn)錄組僅包含 mRNA，實(shí)際研究中默認(rèn)指代狹義轉(zhuǎn)錄組。

Q2：研究轉(zhuǎn)錄組的主要技術(shù)手段有哪些？
A2：主要技術(shù)手段包括基因芯片技術(shù)和 RNA-seq 技術(shù)，其中 RNA-seq 作為高通量測序技術(shù)，在轉(zhuǎn)錄本檢測和基因表達(dá)分析中應(yīng)用廣泛。

1.2 轉(zhuǎn)錄本
所有從基因轉(zhuǎn)錄生成的 RNA 分子均稱為轉(zhuǎn)錄本。不同細(xì)胞（如肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞）雖含相同 DNA 序列，但因開放表達(dá)的基因不同，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本及后續(xù)蛋白質(zhì)存在差異。轉(zhuǎn)錄本分為兩類：一類是可被核糖體翻譯為蛋白質(zhì)的 mRNA；另一類是無法翻譯為蛋白質(zhì)、自身具備功能的非編碼 RNA（ncRNA），如 rRNA、tRNA、siRNA 等。

Q1：轉(zhuǎn)錄本的分類依據(jù)是什么？
A1：分類依據(jù)是能否被翻譯為蛋白質(zhì)，可翻譯為蛋白質(zhì)的是 mRNA，無法翻譯且自身有功能的是非編碼 RNA（ncRNA）。

Q2：不同細(xì)胞類型轉(zhuǎn)錄本存在差異的原因是什么？
A2：原因是不同細(xì)胞中開放表達(dá)的基因不同，即使 DNA 序列一致，基因表達(dá)的選擇性導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本種類和數(shù)量存在差異。

1.3 轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生過程
轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生以 DNA 為模板，具體過程分為兩步：
DNA 中的基因片段先轉(zhuǎn)錄生成 pre-mRNA，該階段生成的 pre-mRNA 包含未翻譯區(qū)域（UTRs）、開放閱讀框（ORF）及內(nèi)含子序列；
轉(zhuǎn)錄后加工階段，pre-mRNA 中的內(nèi)含子被去除，同時(shí)在 RNA 的 5’端添加帽子結(jié)構(gòu)、3’端添加聚腺苷酸尾巴（polyA 尾），最終形成可翻譯為蛋白質(zhì)的成熟 mRNA 轉(zhuǎn)錄本。
其中，mRNA 的 5’帽子結(jié)構(gòu)和 3’polyA 尾具有保護(hù) RNA 免受核酸酶降解、調(diào)控轉(zhuǎn)錄后修飾、參與核轉(zhuǎn)運(yùn)、影響 RNA 穩(wěn)定性及翻譯效率等功能；非編碼 RNA 通常不具備這兩種結(jié)構(gòu)。

Q1：pre-mRNA 加工為成熟 mRNA 的關(guān)鍵步驟是什么？
A1：關(guān)鍵步驟包括內(nèi)含子去除、5’端添加帽子結(jié)構(gòu)、3’端添加 polyA 尾，這三個(gè)步驟共同保障 mRNA 的功能和穩(wěn)定性。

Q2：mRNA 的 5’帽子結(jié)構(gòu)和 3’polyA 尾的核心作用是什么？
A2：核心作用包括保護(hù) mRNA 不被核酸酶降解、調(diào)控轉(zhuǎn)錄后修飾與核轉(zhuǎn)運(yùn)過程、維持 mRNA 穩(wěn)定性及調(diào)控翻譯效率，對(duì) mRNA 的生物學(xué)功能至關(guān)重要。

2. RNA-seq 關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)
2.1 測序深度（Sequencing depth）
測序深度又稱 “乘數(shù)”，是指測序過程中樣本中每個(gè)堿基被檢測到的平均次數(shù)，是衡量測序數(shù)據(jù)量的核心參數(shù)，通常用 “X” 表示（如 100X 代表平均每個(gè)堿基被測序 100 次）。其計(jì)算邏輯為測序獲得的總有效數(shù)據(jù)量與目標(biāo)基因組（或轉(zhuǎn)錄組）大小的比值。

Q1：測序深度的單位 “X” 代表什么含義？
A1：“X” 代表樣本中每個(gè)堿基被測序的平均次數(shù)，例如 50X 即表示平均每個(gè)堿基在測序中被檢測到 50 次。
Q2：計(jì)算測序深度時(shí)，分子和分母分別對(duì)應(yīng)什么數(shù)據(jù)？
A2：分子是測序獲得的總有效數(shù)據(jù)量，分母是目標(biāo)研究對(duì)象（如基因組或轉(zhuǎn)錄組）的總大小，兩者的比值即為測序深度。

2.2 測序覆蓋度（Coverage）
測序覆蓋度又稱 “覆蓋率”，是指測序過程中被檢測到的堿基數(shù)量占目標(biāo)基因組（或轉(zhuǎn)錄組）總堿基數(shù)量的比率，通常用百分比（%）表示。例如，對(duì)人類基因組（大小約 3G）測序后，若有 2.7G 堿基至少被 1 條讀段覆蓋，則測序覆蓋度為 90%（2.7G/3G×100%）。

Q1：測序覆蓋度與測序深度的核心區(qū)別是什么？
A1：測序覆蓋度反映 “被檢測到的堿基范圍占比”，用百分比表示；測序深度反映 “每個(gè)堿基被檢測的平均次數(shù)”，用 “X” 表示，兩者分別從 “范圍” 和 “次數(shù)” 描述測序效果。

Q2：若目標(biāo)基因組大小為 2G，測序后有 1.8G 堿基被覆蓋，其測序覆蓋度是多少？
A2：測序覆蓋度為 90%，計(jì)算方式為被覆蓋的堿基量（1.8G）除以目標(biāo)基因組大小（2G），再乘以 100%。

2.3 reads
reads 是 RNA-seq 測序的直接結(jié)果，指測序過程中儀器檢測到的單條 RNA 序列片段，1 條獨(dú)立的序列片段即稱為 1 條 reads。這些 reads 需后續(xù)通過比對(duì)軟件與參考基因組（或轉(zhuǎn)錄組）進(jìn)行匹配，才能用于基因表達(dá)量計(jì)算、轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)分析等研究。

Q1：reads 在 RNA-seq 研究中的作用是什么？
A1：reads 是 RNA-seq 的原始數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，通過與參考基因組或轉(zhuǎn)錄組比對(duì)，可進(jìn)一步分析基因表達(dá)水平、識(shí)別轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)及發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)錄本。

Q2：1 條 reads 是否等同于 1 個(gè)轉(zhuǎn)錄本？
A2：不等同。1 條 reads 是轉(zhuǎn)錄本的片段序列，1 個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄本通常需要多條 reads 通過拼接或比對(duì)后才能完整呈現(xiàn)。

2.4 adapter（接頭序列）
adapter 是 RNA-seq 文庫構(gòu)建過程中添加到 RNA 片段兩端的短序列，具有類似引物的功能。其核心作用是協(xié)助測序儀器識(shí)別并結(jié)合 RNA 片段，保障測序反應(yīng)的順利啟動(dòng)，測序完成后需通過生物信息學(xué)分析去除 adapter 序列，避免其對(duì)后續(xù)數(shù)據(jù)解讀產(chǎn)生干擾。

Q1：adapter 序列在 RNA-seq 中的核心功能是什么？
A1：核心功能是協(xié)助測序儀器識(shí)別和結(jié)合 RNA 片段，為測序反應(yīng)的啟動(dòng)提供必要條件，是文庫構(gòu)建和測序過程中的關(guān)鍵輔助序列。

Q2：測序完成后為何需要去除 adapter 序列？
A2：因?yàn)?adapter 是人工添加的輔助序列，并非樣本自身的 RNA 片段，若不去除會(huì)干擾基因表達(dá)量計(jì)算、轉(zhuǎn)錄本比對(duì)等后續(xù)分析，影響結(jié)果準(zhǔn)確性。

RNA-seq 核心概念與技術(shù)參數(shù)對(duì)照表

概念類別	術(shù)語名稱	核心定義	關(guān)鍵特點(diǎn) / 計(jì)算方式	應(yīng)用場景
基礎(chǔ)概念	轉(zhuǎn)錄組（廣義）	特定條件下，細(xì)胞 / 組織 / 個(gè)體產(chǎn)生的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物集合，含 mRNA、rRNA、tRNA 及非編碼 RNA	覆蓋所有 RNA 類型，范圍廣	全面分析樣本 RNA 組成時(shí)使用
基礎(chǔ)概念	轉(zhuǎn)錄組（狹義）	特定條件下，細(xì)胞 / 組織 / 個(gè)體產(chǎn)生的所有 mRNA 集合	僅含 mRNA，實(shí)際研究中默認(rèn)指代此類別	基因表達(dá)水平分析的核心對(duì)象
基礎(chǔ)概念	轉(zhuǎn)錄本	從基因轉(zhuǎn)錄生成的所有 RNA 分子，分為可翻譯蛋白質(zhì)的 mRNA 和不可翻譯的非編碼 RNA（ncRNA）	按 “能否翻譯為蛋白質(zhì)” 分類，ncRNA 含 rRNA、tRNA 等，自身具備功能	轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)分析、功能注釋
基礎(chǔ)概念	pre-mRNA	DNA 轉(zhuǎn)錄生成的初始 RNA 產(chǎn)物，含 UTRs、ORF 及內(nèi)含子序列	未經(jīng)過加工，含內(nèi)含子，無法直接翻譯為蛋白質(zhì)	轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制研究
基礎(chǔ)概念	成熟 mRNA	pre-mRNA 去除內(nèi)含子后，添加 5’帽子結(jié)構(gòu)和 3’polyA 尾形成的 RNA 分子	含 5’帽子 + 3’polyA 尾，可被核糖體翻譯，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定	蛋白質(zhì)合成模板、基因表達(dá)定量
技術(shù)參數(shù)	測序深度（Sequencing depth）	樣本中每個(gè)堿基被測序的平均次數(shù)，衡量測序數(shù)據(jù)量的核心參數(shù)	計(jì)算方式：總有效數(shù)據(jù)量 / 目標(biāo)序列（基因組 / 轉(zhuǎn)錄組）大小，單位用 “X” 表示（如 100X）	評(píng)估檢測靈敏度，深度越高越易捕獲低表達(dá)轉(zhuǎn)錄本
技術(shù)參數(shù)	測序覆蓋度（Coverage）	被測序到的堿基占目標(biāo)序列（基因組 / 轉(zhuǎn)錄組）總堿基數(shù)的比率	計(jì)算方式：被覆蓋堿基數(shù) / 目標(biāo)序列總堿基數(shù) ×100%，用百分比表示（如 90%）	評(píng)估測序完整性，覆蓋度越高越全面反映目標(biāo)序列
技術(shù)參數(shù)	reads	RNA-seq 測序的直接結(jié)果，指單條獨(dú)立的 RNA 序列片段	為短序列片段，需與參考基因組 / 轉(zhuǎn)錄組比對(duì)后才能用于后續(xù)分析	基因表達(dá)量計(jì)算、轉(zhuǎn)錄本拼接
技術(shù)參數(shù)	adapter（接頭序列）	文庫構(gòu)建時(shí)添加到 RNA 片段兩端的短序列，具有類似引物的功能	人工添加的輔助序列，測序后需通過生物信息學(xué)手段去除，避免干擾分析	協(xié)助測序反應(yīng)啟動(dòng)，保障測序順利進(jìn)行

3. 總結(jié)
RNA-seq 作為高通量測序技術(shù)，通過檢測轉(zhuǎn)錄組中的 RNA 分子，可實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)水平分析、新轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)及轉(zhuǎn)錄后修飾研究。理解轉(zhuǎn)錄組、轉(zhuǎn)錄本等基礎(chǔ)概念，掌握測序深度、覆蓋度、reads、adapter 等關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)，是開展 RNA-seq 研究及解讀數(shù)據(jù)結(jié)果的核心前提，為后續(xù)基因功能解析、生物過程調(diào)控機(jī)制研究提供基礎(chǔ)支撐。

名稱	貨號(hào)	規(guī)格
轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)實(shí)驗(yàn)服務(wù)	LX-RNAseq	/
轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）檢測試劑盒	LXR-RNAseq	/
NEXTFLEX® Small RNA-Seq Kit v3	NOVA-5132-05	8rxns

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