3D細(xì)胞&類器官培養(yǎng)的 “模塊化” 標(biāo)準(zhǔn)分析方案
還在為類器官檢測數(shù)據(jù)碎片化且不穩(wěn)定而頭疼？Nature Protocols 最新發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)化方案給出了示范答卷：通過序列正交分析方法模塊化設(shè)計，研究者首次實現(xiàn)了對同批 3D 球體的 "全生命周期透視"。 這套方案以 Cytation & BioSpa8 為核心的檢測工作站，正在助力 3D&類器官標(biāo)準(zhǔn)化研究踏上陽光大道。
別具一格的 ULA 3D 細(xì)胞&類器官培養(yǎng)法
類器官的體外培養(yǎng)方式豐富多樣，常見的有基質(zhì)膠浸沒式培養(yǎng)法、低密度 Transwell 孔板氣-液界面培養(yǎng)法，高通量 ULA（超低吸附表面）培養(yǎng)法、Hanging Drop（懸滴）法以及倒置多層氣液界面培養(yǎng)法等。
在眾多培養(yǎng)方法中，高通量 ULA 培養(yǎng)法最初主要用于構(gòu)建 3D 細(xì)胞球。由于其操作簡便，且支持在無外源細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，該方法在類器官領(lǐng)域也逐漸收到關(guān)注。要知道，類器官系統(tǒng)具有高度復(fù)雜性，常常導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，而高通量 ULA 培養(yǎng)法恰好能夠有效解決一老大問題。
圖 1. 高通量（96/384）ULA 法和 Hanging Drop 3D 細(xì)胞球培養(yǎng)法 （DOI:10.1038/s41598-021-03739-1）相比 Hanging Drop 法，ULA 培養(yǎng)更為簡單便捷，支持自動化操作。
此前，奧地利的一個研究團(tuán)隊在 cell 上發(fā)表研究結(jié)果，顯示采用 ULA 培養(yǎng)法構(gòu)建的高通量自組織心臟類器官模型，無需外源 ECM 支持，可以根據(jù)研究需求，靈活調(diào)控類器官的復(fù)雜程度且具有可重復(fù)性，為心臟類器官研究的標(biāo)準(zhǔn)化提供了便利。
目前，眾多研究團(tuán)隊已經(jīng)利用該方法成功構(gòu)建了多種類器官模型，包括乳腺類器官，心臟類器官，膀胱類器官以及骨髓類器官等等。
不過，基于ULA 法的3D 細(xì)胞培養(yǎng)模型在類器官研究領(lǐng)域應(yīng)用時，任然面臨缺乏標(biāo)準(zhǔn)、分析表型受限、方法學(xué)與報告標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一等挑戰(zhàn)。
熱辣出爐的 3D 細(xì)胞球序列正交分析方法：把實驗變成"數(shù)據(jù)拼搭積木"
來自比利時的研究團(tuán)隊在 ULA 培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上建立了一套創(chuàng)新的序列正交分析方案，該方案融合了動態(tài)檢測和終點分析雙模塊。利用此方案，研究人員能夠?qū)ν慌蝮w先開展無損傷監(jiān)測（如動態(tài)形態(tài)追蹤），隨后再進(jìn)行破壞性分析（如單細(xì)胞測序）。
今年 4 月，這項研究成果發(fā)表于 Nature Protocols，該方案具有廣泛適用性，可應(yīng)用于從基礎(chǔ)研究到藥物發(fā)現(xiàn)等多個領(lǐng)域，并覆蓋大部分腫瘤類器官研究場景。
圖 4. 將球體轉(zhuǎn)移至微孔板或者 Eppendorf 管中用于 ATP、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)分析。此模塊中，Cytation 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)用于支持 ATP 測定和特定蛋白定量檢測。
黃金搭檔：Cytation & BioSpa8 智能活細(xì)胞檢測平臺
序列正交分析方案推動類器官領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展和建立
這套基于 ULA 3D 細(xì)胞&類器官培養(yǎng)的序列正交模塊化分析方法結(jié)合研究團(tuán)隊提供的 MIShperoidID 數(shù)據(jù)庫，能夠極大程度推動該領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程，該數(shù)據(jù)庫已收錄 127 種 3D 細(xì)胞球培養(yǎng)方案，提供不同平臺數(shù)據(jù)的可比性。而標(biāo)準(zhǔn)化評價方法非常有助于開啟精準(zhǔn)醫(yī)療新路徑，比如治療響應(yīng)預(yù)測，通過實時追蹤治療后的類器官形態(tài)變化和 ATP 變化曲線，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)解析球體核心區(qū) vs 邊緣細(xì)胞的分子特征，分析類器官的空間異質(zhì)性等，獲得的分析結(jié)果能夠更好的評價和指導(dǎo)臨床用藥方案。
參考文獻(xiàn)
1. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis Hofbauer, Pablo et al. Cell, Volume 184, Issue 12, 3299 - 3317.e22
2. Sequential orthogonal assays for longitudinal and endpoint characterization of three-dimensional spheroids Blondeel, E., Ernst, S., De Vuyst, F. et al. Nat Protoc (2025)
相關(guān)產(chǎn)品：
Cytation 5 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)
關(guān)于安捷倫細(xì)胞分析
安捷倫細(xì)胞分析平臺包括xCELLigence RTCA實時細(xì)胞分析儀、NovoCyte系列流式細(xì)胞儀、Seahorse能量代謝分析儀以及Synergy系列微孔板檢測儀和Cytation 系列（共聚焦）細(xì)胞成像多功能微孔板檢測儀。安捷倫細(xì)胞分析平臺聚焦基礎(chǔ)科研與細(xì)胞與基因治療產(chǎn)品的開發(fā)全流程，作為適配新一代療法的強(qiáng)大分析工具，提供多方位的細(xì)胞效力檢測和深度的細(xì)胞分析，并致力于研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控以及臨床的全方位檢測與分析方案開發(fā)。
別具一格的 ULA 3D 細(xì)胞&類器官培養(yǎng)法
類器官的體外培養(yǎng)方式豐富多樣，常見的有基質(zhì)膠浸沒式培養(yǎng)法、低密度 Transwell 孔板氣-液界面培養(yǎng)法，高通量 ULA（超低吸附表面）培養(yǎng)法、Hanging Drop（懸滴）法以及倒置多層氣液界面培養(yǎng)法等。
在眾多培養(yǎng)方法中，高通量 ULA 培養(yǎng)法最初主要用于構(gòu)建 3D 細(xì)胞球。由于其操作簡便，且支持在無外源細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，該方法在類器官領(lǐng)域也逐漸收到關(guān)注。要知道，類器官系統(tǒng)具有高度復(fù)雜性，常常導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，而高通量 ULA 培養(yǎng)法恰好能夠有效解決一老大問題。
圖 1. 高通量（96/384）ULA 法和 Hanging Drop 3D 細(xì)胞球培養(yǎng)法 （DOI:10.1038/s41598-021-03739-1）相比 Hanging Drop 法，ULA 培養(yǎng)更為簡單便捷，支持自動化操作。
此前，奧地利的一個研究團(tuán)隊在 cell 上發(fā)表研究結(jié)果，顯示采用 ULA 培養(yǎng)法構(gòu)建的高通量自組織心臟類器官模型，無需外源 ECM 支持，可以根據(jù)研究需求，靈活調(diào)控類器官的復(fù)雜程度且具有可重復(fù)性，為心臟類器官研究的標(biāo)準(zhǔn)化提供了便利。
目前，眾多研究團(tuán)隊已經(jīng)利用該方法成功構(gòu)建了多種類器官模型，包括乳腺類器官，心臟類器官，膀胱類器官以及骨髓類器官等等。
不過，基于ULA 法的3D 細(xì)胞培養(yǎng)模型在類器官研究領(lǐng)域應(yīng)用時，任然面臨缺乏標(biāo)準(zhǔn)、分析表型受限、方法學(xué)與報告標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一等挑戰(zhàn)。
熱辣出爐的 3D 細(xì)胞球序列正交分析方法：把實驗變成"數(shù)據(jù)拼搭積木"
來自比利時的研究團(tuán)隊在 ULA 培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上建立了一套創(chuàng)新的序列正交分析方案，該方案融合了動態(tài)檢測和終點分析雙模塊。利用此方案，研究人員能夠?qū)ν慌蝮w先開展無損傷監(jiān)測（如動態(tài)形態(tài)追蹤），隨后再進(jìn)行破壞性分析（如單細(xì)胞測序）。
今年 4 月，這項研究成果發(fā)表于 Nature Protocols，該方案具有廣泛適用性，可應(yīng)用于從基礎(chǔ)研究到藥物發(fā)現(xiàn)等多個領(lǐng)域，并覆蓋大部分腫瘤類器官研究場景。
圖 2. 方案全景，從球體構(gòu)建開始，然后用于多方面動態(tài)和終點表型分析的模塊化分析框架。
該分析檢測方案包括培養(yǎng)基代謝物變化、球體內(nèi)部 ATP 濃度水平以及細(xì)胞死亡的空間分布情況等，通過互補(bǔ)且獨立的正交分析方法，從不同維度對球狀體（spheroids）進(jìn)行表型分析，研究者能夠如同搭樂高積木般，靈活組合各類檢測模塊，以此來實現(xiàn)多維度驗證。
Part 1——球體制備階段：支持自動化的培養(yǎng)流程搭建
此方案中闡述了手動和自動化單細(xì)胞接種操作，到球體收獲、上清液收集，以及在 ULA 板內(nèi)和從 ULA 板進(jìn)行化合物管理的全流程。在此環(huán)節(jié)中，安捷倫的 Bravo 自動化工作站能夠高效完成上清液收集、化合物給藥等操作；而 MultiFloFX 獨有的 AMX 模塊，則非常適合球形底板的培養(yǎng)基更換、清洗等精細(xì)步驟。
Part 2——動態(tài)監(jiān)測階段的縱向分析：成分、形態(tài)與功能三模塊聯(lián)動
在這部分的實驗框架中，設(shè)置了三個主要子模塊：
該分析檢測方案包括培養(yǎng)基代謝物變化、球體內(nèi)部 ATP 濃度水平以及細(xì)胞死亡的空間分布情況等，通過互補(bǔ)且獨立的正交分析方法，從不同維度對球狀體（spheroids）進(jìn)行表型分析，研究者能夠如同搭樂高積木般，靈活組合各類檢測模塊，以此來實現(xiàn)多維度驗證。
Part 1——球體制備階段：支持自動化的培養(yǎng)流程搭建
此方案中闡述了手動和自動化單細(xì)胞接種操作，到球體收獲、上清液收集，以及在 ULA 板內(nèi)和從 ULA 板進(jìn)行化合物管理的全流程。在此環(huán)節(jié)中，安捷倫的 Bravo 自動化工作站能夠高效完成上清液收集、化合物給藥等操作；而 MultiFloFX 獨有的 AMX 模塊，則非常適合球形底板的培養(yǎng)基更換、清洗等精細(xì)步驟。
Part 2——動態(tài)監(jiān)測階段的縱向分析：成分、形態(tài)與功能三模塊聯(lián)動
在這部分的實驗框架中，設(shè)置了三個主要子模塊：
- 上清液成分分析：縱向追蹤球體上清液的動態(tài)變化，突破傳統(tǒng)單時間點檢測的局限，以避免遺漏關(guān)鍵表型或誤判治療效果
- 形態(tài)測量分析：通過光學(xué)顯微鏡觀測球體整體形態(tài)，結(jié)合熒光示蹤技術(shù)（如落射熒光或共聚焦顯微鏡），精準(zhǔn)捕捉細(xì)胞狀態(tài)特異性信息
- 功能活性評估：采用徑向遷移測定和侵襲測定兩大實驗，量化球體的遷移與侵襲能力，從而更真實地反映其生物學(xué)行為
值得一提的是，以上三類分析子模塊均支持在培養(yǎng)過程中開展動態(tài)縱向分析。要知道，單次檢測往往僅能提供類似“快照”的瞬時數(shù)據(jù)，而長期跟蹤監(jiān)測則能夠完整、全面揭示球體的動態(tài)變化，進(jìn)而為更精準(zhǔn)的藥物療效評估提供可靠依據(jù)。
圖 3. 使用 Cytation&BioSpa8 活細(xì)胞工作站動的態(tài)圖像捕獲和圖像定量分析功能，分別在徑向遷移和侵襲試驗中監(jiān)測 SW1353 球體的遷移和侵襲能力
Part 3——終點分析階段：從三維結(jié)構(gòu)到單細(xì)胞水平的超級解構(gòu)
方案的最后一個大模塊是終點分析，從分子到單細(xì)胞再到空間結(jié)構(gòu)，多維度數(shù)據(jù)還原球體真實狀態(tài)，主要包含以下三個子模塊：
1. 分子含量分析：精準(zhǔn)檢測球體裂解后的關(guān)鍵成分
圖 3. 使用 Cytation&BioSpa8 活細(xì)胞工作站動的態(tài)圖像捕獲和圖像定量分析功能，分別在徑向遷移和侵襲試驗中監(jiān)測 SW1353 球體的遷移和侵襲能力
Part 3——終點分析階段：從三維結(jié)構(gòu)到單細(xì)胞水平的超級解構(gòu)
方案的最后一個大模塊是終點分析，從分子到單細(xì)胞再到空間結(jié)構(gòu)，多維度數(shù)據(jù)還原球體真實狀態(tài)，主要包含以下三個子模塊：
1. 分子含量分析：精準(zhǔn)檢測球體裂解后的關(guān)鍵成分
- 能量代謝：ATP（CellTiter-glo 3D 檢測）
- 基因表達(dá)：RNA（RT-qPCR、RNA 測序）
- 蛋白質(zhì)調(diào)控：蛋白質(zhì)印跡、蛋白質(zhì)組學(xué)
- 脂質(zhì)構(gòu)成：專用試劑盒結(jié)合脂質(zhì)組學(xué)
2. 單細(xì)胞層面的解析：制備單細(xì)胞懸液，通過流式細(xì)胞術(shù)深入表征細(xì)胞組成與狀態(tài)。
3. 空間結(jié)構(gòu)的微觀呈現(xiàn)：通過多種高分辨率成像技術(shù)對球體天然結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析
3. 空間結(jié)構(gòu)的微觀呈現(xiàn)：通過多種高分辨率成像技術(shù)對球體天然結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析
- 免疫組織化學(xué) ：可定位目標(biāo)蛋白的空間分布
- 透射電鏡/光片熒光顯微鏡：提供亞細(xì)胞級超清成像
圖 4. 將球體轉(zhuǎn)移至微孔板或者 Eppendorf 管中用于 ATP、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)分析。此模塊中，Cytation 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)用于支持 ATP 測定和特定蛋白定量檢測。
黃金搭檔：Cytation & BioSpa8 智能活細(xì)胞檢測平臺
在這套嚴(yán)謹(jǐn)且科學(xué)的正交分析方案的整體流程里，涵蓋了從 3D 細(xì)胞球&類器官的培養(yǎng)構(gòu)建、動態(tài)監(jiān)測到終點數(shù)據(jù)分析全過程，包含多項子分析模塊。這些模塊中的大多數(shù)，都對培養(yǎng)環(huán)境和檢測環(huán)境的穩(wěn)定性有著較高的要求。而 Cytation 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測儀與 BioSpa8 自動化培養(yǎng)箱的巧妙搭配，恰好能夠全方位地支持該標(biāo)準(zhǔn)分析模塊所涉及的多項實驗，實現(xiàn)“培養(yǎng)-監(jiān)測-分析”的流程閉環(huán)。
BioSpa8 自動化培養(yǎng)箱：支持 8 個板位的 ULA 培養(yǎng)板自動化操作，根據(jù)需要可選擇左側(cè)對接 MultiFloFX 液體處理系統(tǒng)， 定時定點進(jìn)行培養(yǎng)、換液或者成像檢測操作。
Cytation 系列細(xì)胞成像分析系統(tǒng)：將兩套檢測平臺巧妙整合在一套緊湊的空間內(nèi)，實現(xiàn)了微孔板檢測與自動化成像完美結(jié)合，這種設(shè)計，使其非常適配此方案中的細(xì)胞球形態(tài)監(jiān)測、功能分析和分子水平的檢測等各項任務(wù)。為研究者提供全面、準(zhǔn)確且可靠的實驗數(shù)據(jù)。
BioSpa8 自動化培養(yǎng)箱：支持 8 個板位的 ULA 培養(yǎng)板自動化操作，根據(jù)需要可選擇左側(cè)對接 MultiFloFX 液體處理系統(tǒng)， 定時定點進(jìn)行培養(yǎng)、換液或者成像檢測操作。
Cytation 系列細(xì)胞成像分析系統(tǒng)：將兩套檢測平臺巧妙整合在一套緊湊的空間內(nèi)，實現(xiàn)了微孔板檢測與自動化成像完美結(jié)合，這種設(shè)計，使其非常適配此方案中的細(xì)胞球形態(tài)監(jiān)測、功能分析和分子水平的檢測等各項任務(wù)。為研究者提供全面、準(zhǔn)確且可靠的實驗數(shù)據(jù)。
序列正交分析方案推動類器官領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展和建立
這套基于 ULA 3D 細(xì)胞&類器官培養(yǎng)的序列正交模塊化分析方法結(jié)合研究團(tuán)隊提供的 MIShperoidID 數(shù)據(jù)庫，能夠極大程度推動該領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程，該數(shù)據(jù)庫已收錄 127 種 3D 細(xì)胞球培養(yǎng)方案，提供不同平臺數(shù)據(jù)的可比性。而標(biāo)準(zhǔn)化評價方法非常有助于開啟精準(zhǔn)醫(yī)療新路徑，比如治療響應(yīng)預(yù)測，通過實時追蹤治療后的類器官形態(tài)變化和 ATP 變化曲線，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)解析球體核心區(qū) vs 邊緣細(xì)胞的分子特征，分析類器官的空間異質(zhì)性等，獲得的分析結(jié)果能夠更好的評價和指導(dǎo)臨床用藥方案。
參考文獻(xiàn)
1. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis Hofbauer, Pablo et al. Cell, Volume 184, Issue 12, 3299 - 3317.e22
2. Sequential orthogonal assays for longitudinal and endpoint characterization of three-dimensional spheroids Blondeel, E., Ernst, S., De Vuyst, F. et al. Nat Protoc (2025)
相關(guān)產(chǎn)品：
Cytation 5 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)
關(guān)于安捷倫細(xì)胞分析
安捷倫細(xì)胞分析平臺包括xCELLigence RTCA實時細(xì)胞分析儀、NovoCyte系列流式細(xì)胞儀、Seahorse能量代謝分析儀以及Synergy系列微孔板檢測儀和Cytation 系列（共聚焦）細(xì)胞成像多功能微孔板檢測儀。安捷倫細(xì)胞分析平臺聚焦基礎(chǔ)科研與細(xì)胞與基因治療產(chǎn)品的開發(fā)全流程，作為適配新一代療法的強(qiáng)大分析工具，提供多方位的細(xì)胞效力檢測和深度的細(xì)胞分析，并致力于研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控以及臨床的全方位檢測與分析方案開發(fā)。
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