多組學(xué)分析在揭示綿羊早期胚胎發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制中的應(yīng)用
近日，西北農(nóng)林科技大學(xué)博士后金妙函等為第一作者，陳玉林教授和王小龍教授為通訊作者，在國際知名期刊《Journal of Advanced Research》上發(fā)表題為“Efficient derivation of stable sheep embryonic stem cells opens a new avenue for agricultural and biomedical application”的研究論文。研究團(tuán)隊(duì)建立了一種名為TePR（mTeSR PLUS培養(yǎng)基聯(lián)合WNT/β-catenin通路抑制劑IWR-1）的新型培養(yǎng)系統(tǒng)，首次實(shí)現(xiàn)綿羊胚胎干細(xì)胞系（Embryonic Stem Cells, ESCs）的長期穩(wěn)定培養(yǎng)。具體而言，通過整合綿羊胚胎發(fā)育各階段的多組學(xué)數(shù)據(jù)（包括Smart-seq2、ATAC-seq和WGBS），系統(tǒng)描繪了綿羊早期胚胎發(fā)育和ESCs多能性狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄組與表觀遺傳特征。本研究提供的Smart-seq2、ATAC-seq和WGBS技術(shù)，助力揭示綿羊ESCs獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄特征、染色質(zhì)開放狀態(tài)和甲基化模式，為理解反芻動(dòng)物早期發(fā)育和干細(xì)胞多能性調(diào)控機(jī)制提供重要見解。
標(biāo)題：Efficient derivation of stable sheep embryonic stem cells opens a new avenue for agricultural and biomedical application（構(gòu)建高效穩(wěn)定的綿羊胚胎干細(xì)胞系，開啟農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用新途徑）
發(fā)表時(shí)間：2025年7月23日
發(fā)表期刊：Journal of Advanced Research（J Adv Res）
影響因子：IF13/Q1
技術(shù)平臺(tái)：Smart-seq2、ATAC-seq和WGBS
作者單位：西北農(nóng)林科技大學(xué)
DOI：10.1016/j.jare.2025.07.036
易小結(jié)
本研究不僅在綿羊胚胎干細(xì)胞領(lǐng)域取得了重要突破，還通過應(yīng)用和拓展表觀基因組學(xué)和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)，為反芻動(dòng)物干細(xì)胞研究、農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用以及表觀遺傳學(xué)研究提供了新的工具和方法。這些成果不僅具有重要的科學(xué)價(jià)值，還為未來相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了重要的參考和啟示。
易基因提供的Smart-seq2、ATAC-seq和WGBS等多組學(xué)整合技術(shù)支撐，不僅能夠獲得更全面的生物學(xué)信息，還能揭示不同組學(xué)層面之間的相互作用和調(diào)控機(jī)制。這一研究為未來多組學(xué)整合研究提供成功思路，展示了其在復(fù)雜生物系統(tǒng)研究中的巨大潛力。
研究方法
胚胎收集與培養(yǎng)：從雌性綿羊體內(nèi)收集胚胎，并在體外培養(yǎng)至不同發(fā)育階段。
ESC的分離與培養(yǎng)：TePR條件下從囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離綿羊ESC，并進(jìn)行長期培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)錄組分析（Smart-seq2）：對綿羊植入前胚胎（卵母細(xì)胞至囊胚共7個(gè)階段）和ESC進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，分析其基因表達(dá)譜，揭示胚胎基因組激活（Embryonic Genome Activation, EGA）動(dòng)態(tài)。
染色質(zhì)開放性分析（ATAC-seq）：比較TePR-sESCs與綿羊胎兒成纖維細(xì)胞（Sheep Fetal Fibroblasts, SFFs）的染色質(zhì)開放區(qū)域，識別多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合 motif（如POU5F1、SOX2）。
全基因組甲基化分析（WGBS）：對ESC和成纖維細(xì)胞進(jìn)行WGBS，分析DNA甲基化模式，定位差異甲基化區(qū)域（DMRs）。
基因編輯：利用PiggyBac轉(zhuǎn)座和CRISPR/Cas9技術(shù)對ESC進(jìn)行基因編輯，驗(yàn)證其基因編輯能力。
嵌合體實(shí)驗(yàn)：將ESC注入早期囊胚，觀察其在嵌合體胚胎中的貢獻(xiàn)。
結(jié)果圖形
（1）TePR培養(yǎng)基支持綿羊ESC系的構(gòu)建和長期穩(wěn)定培養(yǎng)
研究者測試了四種不同的培養(yǎng)條件（NBFR、bEPSCM、3i/LAF和TePR），發(fā)現(xiàn)TePR條件下的綿羊ESC（TePR-sESCs）能夠成功構(gòu)建并長期穩(wěn)定培養(yǎng)。TePR-sESCs展現(xiàn)出穩(wěn)定的形態(tài)，能夠在單細(xì)胞水平上傳代，并在超過100代后保持未分化狀態(tài)。這些細(xì)胞表達(dá)多能性標(biāo)記基因（如POU5F1、SOX2和NANOG），并通過胚胎體（EB）分化實(shí)驗(yàn)顯示出三胚層分化潛力。這些結(jié)果表明，TePR培養(yǎng)基能夠支持綿羊ESC的建立和長期穩(wěn)定培養(yǎng)，為后續(xù)研究提供可靠的細(xì)胞模型。
圖1：TePR-sESCs的生成與表征
(A) TePR-sESCs從第6天體內(nèi)受精胚胎中分離的示意圖。
(B) TePR-sESCs的明場圖像和堿性磷酸酶（AP）染色。
(C) TePR-sESCs的核型分析。
(D) 使用RT-qPCR分析TePR-sESCs的核心多能性基因（POU5F1、SOX2、NANOG、LIN28和SALL4）的基因表達(dá)。
(E) TePR-sESCs（P10）和TePR-sESCs（P100）的單細(xì)胞克隆效率。
(F) 體外胚狀體（EB）分化實(shí)驗(yàn)。通過RT-PCR檢測外胚層（OTX2、PAX3、KRT8和NESTIN）、中胚層（PDGFRA和ACTA2）和內(nèi)胚層（FOXA2和GATA6）特異性基因的表達(dá)。
(G) 體內(nèi)畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)。TePR-sESCs形成的畸胎瘤的H&E染色。
(H) 免疫染色檢測POU5F1、SOX2、NANOG、SSEA4、TRA-1–81和TRA-1–60。
(I) 免疫染色檢測AFP、GATA6、SMA、Nestin和Tublin。
（2）TePR-sESCs的轉(zhuǎn)錄組表征
通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組Smart-seq2分析顯示，綿羊EGA發(fā)生于8細(xì)胞期至桑椹胚階段。TePR-sESCs的轉(zhuǎn)錄組特征與8細(xì)胞/桑椹胚胚胎高度相似，但多能基因表達(dá)模式存在差異：如POU5F1在桑椹胚中高表達(dá)，而在TePR-sESCs中下調(diào)。差異表達(dá)基因（DEGs）富集于WNT/BMP信號通路、胚胎器官形態(tài)發(fā)生等，提示TePR-sESCs處于一種接近胚胎早期發(fā)育的多能狀態(tài)，這些結(jié)果揭示了TePR-sESCs獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄組特征。
(B) 樣本相關(guān)性熱圖（MII卵母細(xì)胞、受精卵、2細(xì)胞期、8細(xì)胞期、桑椹胚、早期囊胚、晚期囊胚以及TePR-sESCs）。
(C) 不同胚胎階段（MII卵母細(xì)胞、受精卵、2細(xì)胞期、8細(xì)胞期、桑椹胚、早期囊胚、晚期囊胚以及TePR-sESCs）的基因表達(dá)水平。
(D) TePR-sESCs與不同胚胎階段的主成分分析。
(E) 8細(xì)胞期胚胎、桑椹胚和TePR-sESCs中標(biāo)記基因表達(dá)的箱線圖。
(F) 8細(xì)胞期胚胎與TePR-sESCs之間差異表達(dá)基因（DEGs）的火山圖。
(G) 8細(xì)胞期胚胎與TePR-sESCs之間差異表達(dá)基因（DEGs）的GO富集分析。
(H) 桑椹胚與TePR-sESCs之間差異表達(dá)基因（DEGs）的火山圖。
(I) 桑椹胚與TePR-sESCs之間差異表達(dá)基因（DEGs）的GO富集分析。
（3）TePR-sESCs的表觀遺傳表征
利用ATAC-seq和WGBS技術(shù)，研究者分析了TePR-sESCs的染色質(zhì)可及性和DNA甲基化模式。ATAC-seq結(jié)果顯示，TePR-sESCs的染色質(zhì)可及區(qū)域顯著多于成纖維細(xì)胞，且這些區(qū)域富含多能性轉(zhuǎn)錄因子（如POU5F1、SOX2和NANOG）的結(jié)合位點(diǎn)。WGBS結(jié)果顯示，TePR-sESCs的DNA甲基化水平約為82%，與人類、豬和牛的EPSCs相似。這些結(jié)果表明，TePR-sESCs具有獨(dú)特的表觀遺傳特征，這些特征可能與其多能性狀態(tài)密切相關(guān)。
ATAC-seq：TePR-sESCs的染色質(zhì)開放區(qū)域（DARs）顯著多于綿羊胎兒成纖維細(xì)胞（SFFs），且富集于多能基因啟動(dòng)子區(qū)（如POU5F1、NANOG）（圖3A-D）。差異可及性基因參與cAMP/WNT信號通路（圖3E），表明表觀遺傳調(diào)控與多能性維持密切相關(guān)。
WGBS：TePR-sESCs全基因組甲基化水平約82%，與人類、豬和牛等物種的primed ESCs相似（圖3F）。DMRs主要位于基因間區(qū)和內(nèi)含子區(qū)，且與TSS鄰近區(qū)域的染色質(zhì)可及性呈負(fù)相關(guān)（圖3H），印證了DNA甲基化對基因表達(dá)的抑制作用。
圖3：TePR-sESC的表觀遺傳表征。
（A）TePR-sESC和SFF的總ATAC-seq水平。
（B）TePR-sESC和SFF之間不同基因組區(qū)域（啟動(dòng)子、內(nèi)含子、編碼外顯子和遠(yuǎn)端基因間區(qū)域）內(nèi)DAR分布。
（C）每個(gè)基因組區(qū)域中DAR豐度小提琴圖。
（D）TePR-sESCs和SFF中ATAC-seq peaks的motif富集分析。
（E）與SFF相比，TePR-sESC中富集具有不同染色質(zhì)可及性的基因通路。
（F）TePR-sESC和SFF的DNA甲基化水平。
（G）TePR-sESC和SFF之間不同基因組區(qū)域（啟動(dòng)子、外顯子、基因間和內(nèi)含子區(qū)域）內(nèi)DMR的分布。（H）轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的平均DNA甲基化水平和DAR分布（TSS±3Kb）。
（4）TePR-sESCs的特異性基因網(wǎng)絡(luò)
通過整合多組學(xué)（DEGs+DARs+DMGs）數(shù)據(jù)，研究團(tuán)隊(duì)鑒定出13個(gè)在TePR-sESCs中具有特異性表達(dá)模式基因（如PDE4D、SIX6、MECOM和TBX18）。這些基因在cAMP、MAPK、細(xì)胞間連接和Ras信號通路中富集。此外研究者還分析了TePR-sESCs與其他物種（豬、牛）ESC的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)TePR-sESCs與人類naive ESCs的表達(dá)模式最為接近。這些結(jié)果揭示了TePR-sESCs特異性的基因網(wǎng)絡(luò)特征，為研究綿羊胚胎發(fā)育和ESC多能性提供了新視角。
（B）TePR-sESC、pEPSC、bESC、hNaive ESC、hEPS和hPrimed ESC的維恩。
（C）TePR-sESCs獨(dú)特表達(dá)基因的GO富集分析。
（D）TePR-sESCs和SFFs中印記基因的表達(dá)。
（E）TePR-sESCs和SFFs中組蛋白基因的表達(dá)水平。
（F）TePR-sESCs和SFFs的DMR、DAR和DEG重疊。
（5）WNT信號通路維持TePR-sESCs多能性
研究者發(fā)現(xiàn)，WNT信號通路抑制劑IWR-1對于維持TePR-sESCs的多能性至關(guān)重要。去除IWR-1會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變、堿性磷酸酶（AP）染色減弱以及多能性標(biāo)記基因表達(dá)下降，而用同類型抑制劑XAV939替代后不會(huì)影響細(xì)胞的多能性。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了WNT信號通路在維持TePR-sESCs多能性中的關(guān)鍵作用。
（B）qRT-PCR對多能性相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的定量分析。
（C）POU5F1、SOX2和NANOG的免疫熒光染色結(jié)果。
（6）TePR-sESCs實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)基因編輯
研究者利用PiggyBac技術(shù)在TePR-sESCs中成功敲入mCherry基因，并通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除肌肉生長抑制素（MSTN）基因。Sanger測序和深度測序結(jié)果顯示，基因編輯效率高達(dá)93.9%和97.4%。Western blotting結(jié)果表明，編輯后的細(xì)胞不表達(dá)MSTN蛋白。此外，這些基因編輯后的細(xì)胞仍保持多能性。這些結(jié)果表明，TePR-sESCs能夠耐受多輪基因編輯，為農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了強(qiáng)大的工具。
圖6：TePR-sESCs的基因編輯表現(xiàn)
（A）基因編輯流程示意圖。
（B）mCherry標(biāo)記的TePR-sESCs熒光圖像。
（C）MSTN基因敲除（MSTN-/-）的TePR-sESCs圖像。
（D）MSTN-/- TePR-sESCs的編輯效率統(tǒng)計(jì)。
（E）MSTN-/- TePR-sESCs的Western blotting檢測結(jié)果，驗(yàn)證MSTN蛋白表達(dá)缺失。
（F）MSTN-/- TePR-sESCs中多能性基因的qRT-PCR分析。
結(jié)果和啟示
本研究通過整合Smart-seq2、ATAC-seq和WGBS技術(shù)，首次系統(tǒng)地描繪了綿羊早期胚胎發(fā)育和ESC多能性狀態(tài)的分子與表觀遺傳全景圖。研究揭示了綿羊ESC獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳特征，并成功實(shí)現(xiàn)了基因編輯。這些結(jié)果不僅增進(jìn)了我們對反芻動(dòng)物早期發(fā)育和干細(xì)胞多能性調(diào)控機(jī)制的理解，還為未來的農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)研究提供了新的工具和方法。未來的研究可以進(jìn)一步探索這些技術(shù)在其他物種中的應(yīng)用，以揭示更多關(guān)于胚胎發(fā)育和干細(xì)胞多能性的奧秘。
參考文獻(xiàn)：
Jin M, Huang S, Zhou S, Shen W, Cao J, Song S, Wei Y, Kalds P, Hua J, Ma B, Ross PJ, Wang X, Chen Y. Efficient derivation of stable sheep embryonic stem cells opens a new avenue for agricultural and biomedical application. J Adv Res. 2025 Jul 23. doi: 10.1016/j.jare.2025.07.036.
標(biāo)題：Efficient derivation of stable sheep embryonic stem cells opens a new avenue for agricultural and biomedical application（構(gòu)建高效穩(wěn)定的綿羊胚胎干細(xì)胞系，開啟農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用新途徑）
發(fā)表時(shí)間：2025年7月23日
發(fā)表期刊：Journal of Advanced Research（J Adv Res）
影響因子：IF13/Q1
技術(shù)平臺(tái)：Smart-seq2、ATAC-seq和WGBS
作者單位：西北農(nóng)林科技大學(xué)
DOI：10.1016/j.jare.2025.07.036
胚胎干細(xì)胞系（ESCs）可分化為所有成體細(xì)胞類型，在農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有變革性潛力。然而，綿羊穩(wěn)定ESCs的分離仍然具有挑戰(zhàn)性，限制其在進(jìn)一步研究中的應(yīng)用。本研究旨在通過簡化方案建立穩(wěn)定的綿羊ESCs，保留其多能性。通過含有IWR-1的培養(yǎng)系統(tǒng)（稱為TePR）從囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離綿羊胚胎干細(xì)胞。通過長期培養(yǎng)（>100代）、三胚層分化、轉(zhuǎn)錄組分析（E0-E6胚胎）和跨物種比較來評估多能性。其中，轉(zhuǎn)錄組學(xué)顯示TePR條件下分離培養(yǎng)的綿羊胚胎干細(xì)胞系（稱為TePR-sESCs）與8細(xì)胞/桑椹胚相似，且與綿羊基因組激活時(shí)間一致。此外，ATAC-seq揭示了其多能性基因（如POU5F1、NANOG）的染色質(zhì)可及性。WGBS鑒定出多能性相關(guān)區(qū)域的低甲基化。TePR-sESCs在長期培養(yǎng)后仍保持正常核型、核心多能性基因表達(dá)（如POU5F1、NANOG）和三胚層分化能力，且耐受多輪基因編輯（如mCherry敲入和MSTN基因敲除），為農(nóng)業(yè)育種和生物醫(yī)學(xué)研究提供重要工具。
圖形摘要
易小結(jié)
本研究不僅在綿羊胚胎干細(xì)胞領(lǐng)域取得了重要突破，還通過應(yīng)用和拓展表觀基因組學(xué)和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)，為反芻動(dòng)物干細(xì)胞研究、農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用以及表觀遺傳學(xué)研究提供了新的工具和方法。這些成果不僅具有重要的科學(xué)價(jià)值，還為未來相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了重要的參考和啟示。
易基因提供的Smart-seq2、ATAC-seq和WGBS等多組學(xué)整合技術(shù)支撐，不僅能夠獲得更全面的生物學(xué)信息，還能揭示不同組學(xué)層面之間的相互作用和調(diào)控機(jī)制。這一研究為未來多組學(xué)整合研究提供成功思路，展示了其在復(fù)雜生物系統(tǒng)研究中的巨大潛力。
研究方法
胚胎收集與培養(yǎng)：從雌性綿羊體內(nèi)收集胚胎，并在體外培養(yǎng)至不同發(fā)育階段。
ESC的分離與培養(yǎng)：TePR條件下從囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離綿羊ESC，并進(jìn)行長期培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)錄組分析（Smart-seq2）：對綿羊植入前胚胎（卵母細(xì)胞至囊胚共7個(gè)階段）和ESC進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，分析其基因表達(dá)譜，揭示胚胎基因組激活（Embryonic Genome Activation, EGA）動(dòng)態(tài)。
染色質(zhì)開放性分析（ATAC-seq）：比較TePR-sESCs與綿羊胎兒成纖維細(xì)胞（Sheep Fetal Fibroblasts, SFFs）的染色質(zhì)開放區(qū)域，識別多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合 motif（如POU5F1、SOX2）。
全基因組甲基化分析（WGBS）：對ESC和成纖維細(xì)胞進(jìn)行WGBS，分析DNA甲基化模式，定位差異甲基化區(qū)域（DMRs）。
基因編輯：利用PiggyBac轉(zhuǎn)座和CRISPR/Cas9技術(shù)對ESC進(jìn)行基因編輯，驗(yàn)證其基因編輯能力。
嵌合體實(shí)驗(yàn)：將ESC注入早期囊胚，觀察其在嵌合體胚胎中的貢獻(xiàn)。
結(jié)果圖形
（1）TePR培養(yǎng)基支持綿羊ESC系的構(gòu)建和長期穩(wěn)定培養(yǎng)
研究者測試了四種不同的培養(yǎng)條件（NBFR、bEPSCM、3i/LAF和TePR），發(fā)現(xiàn)TePR條件下的綿羊ESC（TePR-sESCs）能夠成功構(gòu)建并長期穩(wěn)定培養(yǎng)。TePR-sESCs展現(xiàn)出穩(wěn)定的形態(tài)，能夠在單細(xì)胞水平上傳代，并在超過100代后保持未分化狀態(tài)。這些細(xì)胞表達(dá)多能性標(biāo)記基因（如POU5F1、SOX2和NANOG），并通過胚胎體（EB）分化實(shí)驗(yàn)顯示出三胚層分化潛力。這些結(jié)果表明，TePR培養(yǎng)基能夠支持綿羊ESC的建立和長期穩(wěn)定培養(yǎng)，為后續(xù)研究提供可靠的細(xì)胞模型。
圖1：TePR-sESCs的生成與表征
(B) TePR-sESCs的明場圖像和堿性磷酸酶（AP）染色。
(C) TePR-sESCs的核型分析。
(D) 使用RT-qPCR分析TePR-sESCs的核心多能性基因（POU5F1、SOX2、NANOG、LIN28和SALL4）的基因表達(dá)。
(E) TePR-sESCs（P10）和TePR-sESCs（P100）的單細(xì)胞克隆效率。
(F) 體外胚狀體（EB）分化實(shí)驗(yàn)。通過RT-PCR檢測外胚層（OTX2、PAX3、KRT8和NESTIN）、中胚層（PDGFRA和ACTA2）和內(nèi)胚層（FOXA2和GATA6）特異性基因的表達(dá)。
(G) 體內(nèi)畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)。TePR-sESCs形成的畸胎瘤的H&E染色。
(H) 免疫染色檢測POU5F1、SOX2、NANOG、SSEA4、TRA-1–81和TRA-1–60。
(I) 免疫染色檢測AFP、GATA6、SMA、Nestin和Tublin。
（2）TePR-sESCs的轉(zhuǎn)錄組表征
通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組Smart-seq2分析顯示，綿羊EGA發(fā)生于8細(xì)胞期至桑椹胚階段。TePR-sESCs的轉(zhuǎn)錄組特征與8細(xì)胞/桑椹胚胚胎高度相似，但多能基因表達(dá)模式存在差異：如POU5F1在桑椹胚中高表達(dá)，而在TePR-sESCs中下調(diào)。差異表達(dá)基因（DEGs）富集于WNT/BMP信號通路、胚胎器官形態(tài)發(fā)生等，提示TePR-sESCs處于一種接近胚胎早期發(fā)育的多能狀態(tài)，這些結(jié)果揭示了TePR-sESCs獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄組特征。
圖2：TePR-sESCs的轉(zhuǎn)錄特征分析
(A) 轉(zhuǎn)錄組測序示意圖。(B) 樣本相關(guān)性熱圖（MII卵母細(xì)胞、受精卵、2細(xì)胞期、8細(xì)胞期、桑椹胚、早期囊胚、晚期囊胚以及TePR-sESCs）。
(C) 不同胚胎階段（MII卵母細(xì)胞、受精卵、2細(xì)胞期、8細(xì)胞期、桑椹胚、早期囊胚、晚期囊胚以及TePR-sESCs）的基因表達(dá)水平。
(D) TePR-sESCs與不同胚胎階段的主成分分析。
(E) 8細(xì)胞期胚胎、桑椹胚和TePR-sESCs中標(biāo)記基因表達(dá)的箱線圖。
(F) 8細(xì)胞期胚胎與TePR-sESCs之間差異表達(dá)基因（DEGs）的火山圖。
(G) 8細(xì)胞期胚胎與TePR-sESCs之間差異表達(dá)基因（DEGs）的GO富集分析。
(H) 桑椹胚與TePR-sESCs之間差異表達(dá)基因（DEGs）的火山圖。
(I) 桑椹胚與TePR-sESCs之間差異表達(dá)基因（DEGs）的GO富集分析。
（3）TePR-sESCs的表觀遺傳表征
利用ATAC-seq和WGBS技術(shù)，研究者分析了TePR-sESCs的染色質(zhì)可及性和DNA甲基化模式。ATAC-seq結(jié)果顯示，TePR-sESCs的染色質(zhì)可及區(qū)域顯著多于成纖維細(xì)胞，且這些區(qū)域富含多能性轉(zhuǎn)錄因子（如POU5F1、SOX2和NANOG）的結(jié)合位點(diǎn)。WGBS結(jié)果顯示，TePR-sESCs的DNA甲基化水平約為82%，與人類、豬和牛的EPSCs相似。這些結(jié)果表明，TePR-sESCs具有獨(dú)特的表觀遺傳特征，這些特征可能與其多能性狀態(tài)密切相關(guān)。
ATAC-seq：TePR-sESCs的染色質(zhì)開放區(qū)域（DARs）顯著多于綿羊胎兒成纖維細(xì)胞（SFFs），且富集于多能基因啟動(dòng)子區(qū)（如POU5F1、NANOG）（圖3A-D）。差異可及性基因參與cAMP/WNT信號通路（圖3E），表明表觀遺傳調(diào)控與多能性維持密切相關(guān)。
WGBS：TePR-sESCs全基因組甲基化水平約82%，與人類、豬和牛等物種的primed ESCs相似（圖3F）。DMRs主要位于基因間區(qū)和內(nèi)含子區(qū)，且與TSS鄰近區(qū)域的染色質(zhì)可及性呈負(fù)相關(guān)（圖3H），印證了DNA甲基化對基因表達(dá)的抑制作用。
圖3：TePR-sESC的表觀遺傳表征。
（B）TePR-sESC和SFF之間不同基因組區(qū)域（啟動(dòng)子、內(nèi)含子、編碼外顯子和遠(yuǎn)端基因間區(qū)域）內(nèi)DAR分布。
（C）每個(gè)基因組區(qū)域中DAR豐度小提琴圖。
（D）TePR-sESCs和SFF中ATAC-seq peaks的motif富集分析。
（E）與SFF相比，TePR-sESC中富集具有不同染色質(zhì)可及性的基因通路。
（F）TePR-sESC和SFF的DNA甲基化水平。
（G）TePR-sESC和SFF之間不同基因組區(qū)域（啟動(dòng)子、外顯子、基因間和內(nèi)含子區(qū)域）內(nèi)DMR的分布。（H）轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的平均DNA甲基化水平和DAR分布（TSS±3Kb）。
（4）TePR-sESCs的特異性基因網(wǎng)絡(luò)
通過整合多組學(xué)（DEGs+DARs+DMGs）數(shù)據(jù)，研究團(tuán)隊(duì)鑒定出13個(gè)在TePR-sESCs中具有特異性表達(dá)模式基因（如PDE4D、SIX6、MECOM和TBX18）。這些基因在cAMP、MAPK、細(xì)胞間連接和Ras信號通路中富集。此外研究者還分析了TePR-sESCs與其他物種（豬、牛）ESC的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)TePR-sESCs與人類naive ESCs的表達(dá)模式最為接近。這些結(jié)果揭示了TePR-sESCs特異性的基因網(wǎng)絡(luò)特征，為研究綿羊胚胎發(fā)育和ESC多能性提供了新視角。
圖4：TePR-sESC的特定基因網(wǎng)絡(luò)特征
（A） 比較 TePR-sESC、pEPSC、bESC、hNaive ESC、hEPS 和 hPrimed ESC 的 PCA 分析。（B）TePR-sESC、pEPSC、bESC、hNaive ESC、hEPS和hPrimed ESC的維恩。
（C）TePR-sESCs獨(dú)特表達(dá)基因的GO富集分析。
（D）TePR-sESCs和SFFs中印記基因的表達(dá)。
（E）TePR-sESCs和SFFs中組蛋白基因的表達(dá)水平。
（F）TePR-sESCs和SFFs的DMR、DAR和DEG重疊。
（5）WNT信號通路維持TePR-sESCs多能性
研究者發(fā)現(xiàn)，WNT信號通路抑制劑IWR-1對于維持TePR-sESCs的多能性至關(guān)重要。去除IWR-1會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變、堿性磷酸酶（AP）染色減弱以及多能性標(biāo)記基因表達(dá)下降，而用同類型抑制劑XAV939替代后不會(huì)影響細(xì)胞的多能性。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了WNT信號通路在維持TePR-sESCs多能性中的關(guān)鍵作用。
圖5：WNT信號通路抑制劑維持TePR-sESCs的多能性
（A）比較IWR-1缺失和XAV939添加條件下培養(yǎng)的TePR-sESCs的形態(tài)與AP染色。（B）qRT-PCR對多能性相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的定量分析。
（C）POU5F1、SOX2和NANOG的免疫熒光染色結(jié)果。
（6）TePR-sESCs實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)基因編輯
研究者利用PiggyBac技術(shù)在TePR-sESCs中成功敲入mCherry基因，并通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除肌肉生長抑制素（MSTN）基因。Sanger測序和深度測序結(jié)果顯示，基因編輯效率高達(dá)93.9%和97.4%。Western blotting結(jié)果表明，編輯后的細(xì)胞不表達(dá)MSTN蛋白。此外，這些基因編輯后的細(xì)胞仍保持多能性。這些結(jié)果表明，TePR-sESCs能夠耐受多輪基因編輯，為農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了強(qiáng)大的工具。
圖6：TePR-sESCs的基因編輯表現(xiàn)
（B）mCherry標(biāo)記的TePR-sESCs熒光圖像。
（C）MSTN基因敲除（MSTN-/-）的TePR-sESCs圖像。
（D）MSTN-/- TePR-sESCs的編輯效率統(tǒng)計(jì)。
（E）MSTN-/- TePR-sESCs的Western blotting檢測結(jié)果，驗(yàn)證MSTN蛋白表達(dá)缺失。
（F）MSTN-/- TePR-sESCs中多能性基因的qRT-PCR分析。
結(jié)果和啟示
本研究通過整合Smart-seq2、ATAC-seq和WGBS技術(shù)，首次系統(tǒng)地描繪了綿羊早期胚胎發(fā)育和ESC多能性狀態(tài)的分子與表觀遺傳全景圖。研究揭示了綿羊ESC獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳特征，并成功實(shí)現(xiàn)了基因編輯。這些結(jié)果不僅增進(jìn)了我們對反芻動(dòng)物早期發(fā)育和干細(xì)胞多能性調(diào)控機(jī)制的理解，還為未來的農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)研究提供了新的工具和方法。未來的研究可以進(jìn)一步探索這些技術(shù)在其他物種中的應(yīng)用，以揭示更多關(guān)于胚胎發(fā)育和干細(xì)胞多能性的奧秘。
參考文獻(xiàn)：
Jin M, Huang S, Zhou S, Shen W, Cao J, Song S, Wei Y, Kalds P, Hua J, Ma B, Ross PJ, Wang X, Chen Y. Efficient derivation of stable sheep embryonic stem cells opens a new avenue for agricultural and biomedical application. J Adv Res. 2025 Jul 23. doi: 10.1016/j.jare.2025.07.036.
- 現(xiàn)貨型新生抗原疫苗聯(lián)合ICI在晚期纖維板層型肝癌中展現(xiàn)治療潛力
- 解鎖細(xì)胞年齡的密碼：端粒檢測如何成為健康管理新視角？
- 多組學(xué)分析揭示DNA低甲基化定義人組織調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表觀遺傳適應(yīng)性
- Polysome Profiling—解析翻譯調(diào)控機(jī)制的金標(biāo)準(zhǔn)
- Ribo-seq—檢測正在翻譯的RNA信息 連接轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)的橋梁
- Science：利用大規(guī)模并行核糖體分析發(fā)現(xiàn)泛病毒ORF
- 微量WGBS揭示DNA甲基化調(diào)控斑馬魚造血干細(xì)胞發(fā)育的表觀遺傳機(jī)制
- 單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展歷程、技術(shù)原理及與傳統(tǒng)測序的區(qū)別
- 伯豪&真邁簽署戰(zhàn)略合作協(xié)議，共建多組學(xué)應(yīng)用新平臺(tái)
- 伯豪生物攜時(shí)空組學(xué)技術(shù)平臺(tái)亮相全國系統(tǒng)生物學(xué)大會(huì)
- 開學(xué)季促銷，LabEx DSP空間組學(xué)測序免費(fèi)送12個(gè)ROI
- 新址新程，豪創(chuàng)未來-伯豪生物喬遷慶典圓滿舉行
- 樂備實(shí)LabEx助力發(fā)文獎(jiǎng)勵(lì)進(jìn)行中，最高獲2000元現(xiàn)金
- 中國首批AVITI24原位多組學(xué)平臺(tái)實(shí)測數(shù)據(jù)發(fā)布
- 伯豪生物2025系列培訓(xùn)班（上海站）報(bào)名開啟
- 2025伯豪生物春季全國巡講開啟，早鳥報(bào)名搶占先機(jī)
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com