180微米深度高保真超分辨率成像重建圖像線性相關(guān)性高達(dá)92%
本研究成果由Qianxi Liang、Wei Ren、Boya Jin、Liang Qiao、Xichuan Ge、Yunzhe Fu、Xiaoqi Lv、Meiqi Li和Peng Xi共同完成，論文題為“High-fidelity tissue super-resolution imaging achieved with confocal2 spinning-disk image scanning microscopy”，于2025年發(fā)表在《Light: Science & Applications》期刊。
重要發(fā)現(xiàn)
01光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)與硬件實(shí)現(xiàn)
C2SD-ISM系統(tǒng)的核心在于其創(chuàng)新的光學(xué)配置，它巧妙融合了旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡和數(shù)字微鏡設(shè)備。旋轉(zhuǎn)盤被放置在樣本共軛平面上，通過物理方式實(shí)時(shí)移除離焦信號(hào)，從而減少背景干擾對(duì)后續(xù)重建過程的影響。數(shù)字微鏡設(shè)備則用于生成稀疏多焦點(diǎn)照明模式，這種照明方式通過程序化控制實(shí)現(xiàn)高效采樣。系統(tǒng)采用多模激光作為光源，并結(jié)合方形勻化光纖，確保照明均勻且無散斑。光學(xué)路徑中，樣本焦平面、旋轉(zhuǎn)盤針孔陣列、數(shù)字微鏡設(shè)備和sCMOS傳感器平面均處于共軛狀態(tài)，保證了成像的精確性。數(shù)字微鏡設(shè)備的衍射特性經(jīng)過系統(tǒng)優(yōu)化，入射角設(shè)置為26.3°，可在多色成像（如561nm、488nm和405nm波長(zhǎng)）中實(shí)現(xiàn)超過95%的衍射效率，出口角差異控制在可接受范圍內(nèi)，從而避免了視場(chǎng)偏差和照明不均問題。
旋轉(zhuǎn)盤的設(shè)計(jì)采用阿基米德螺旋排列的針孔陣列，通過電子束光刻和蝕刻工藝制成。為了提升成像速度，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了多同心螺旋設(shè)計(jì)（N>1），將全視場(chǎng)分為N個(gè)子區(qū)域進(jìn)行并行掃描。理論表明，這種設(shè)計(jì)可將均勻照明速度提升N倍，例如當(dāng)N=12時(shí)，曝光時(shí)間間隔縮短至原設(shè)計(jì)的1/12，從而簡(jiǎn)化了與旋轉(zhuǎn)速度的同步操作。針孔直徑與間距的比值設(shè)置為50μm:250μm，以平衡信噪比和分辨率。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明，旋轉(zhuǎn)盤能有效增強(qiáng)成像對(duì)比度：在小鼠腎臟組織切片成像中，引入旋轉(zhuǎn)盤后，局部對(duì)比度提升約三倍，且多焦點(diǎn)照明模式下的信噪比和點(diǎn)信號(hào)清晰度顯著改善。這為后續(xù)算法重建提供了高質(zhì)量輸入數(shù)據(jù)。
03DPA-PR重建算法的高保真實(shí)現(xiàn)
傳統(tǒng)圖像掃描顯微鏡重建通�；诶硐朦c(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)假設(shè)，但實(shí)際系統(tǒng)中存在斯托克斯位移和光學(xué)像差，導(dǎo)致重建保真度下降。C2SD-ISM系統(tǒng)引入了動(dòng)態(tài)針孔陣列像素重分配算法，該算法通過構(gòu)建虛擬探測(cè)器陣列來模擬多視角成像。具體過程包括：首先定位照明光學(xué)軸，然后對(duì)原始圖像進(jìn)行采樣和重組，生成25張共聚焦子圖像，最后通過相位互相關(guān)進(jìn)行配準(zhǔn)和疊加。重建結(jié)果進(jìn)一步通過去卷積處理，實(shí)現(xiàn)近兩倍的分辨率提升。與常規(guī)像素重分配方法相比，DPA-PR算法能自適應(yīng)校正非理想因素，重建圖像與衍射極限共聚焦圖像的峰值信噪比和結(jié)構(gòu)相似性指數(shù)更高，線性相關(guān)性R²達(dá)到0.92，顯著降低了偽影。
04成像性能與生物應(yīng)用驗(yàn)證
通過模擬實(shí)驗(yàn)和生物組織成像，C2SD-ISM系統(tǒng)展現(xiàn)了卓越的3D分辨率提升。在合成微管數(shù)據(jù)集中，引入旋轉(zhuǎn)盤后，DPA-PR重建的橫向分辨率提升至144納米，軸向分辨率達(dá)351納米，且結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)更清晰。與計(jì)算背景去除算法（如滾動(dòng)球和小波去噪）相比，旋轉(zhuǎn)盤的物理離焦信號(hào)去除能更好地保留樣本結(jié)構(gòu)信息，實(shí)現(xiàn)更高的保真度。在實(shí)際生物樣本如小鼠腎臟切片中，系統(tǒng)在12微米厚度樣本上實(shí)現(xiàn)了高對(duì)比度成像，穿透深度達(dá)180微米。多色成像實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了系統(tǒng)在tri-color標(biāo)記樣本（如線粒體、F-肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞核）中的穩(wěn)定性，視場(chǎng)均勻性無波長(zhǎng)差異。此外，系統(tǒng)的高通量能力通過斑馬魚血管3D成像得到體現(xiàn)，拼接成像覆蓋2.91 mm x 1.26 mm x 0.18 mm體積，分辨率媲美高數(shù)值孔徑物鏡的共聚焦成像。
創(chuàng)新與亮點(diǎn)
C2SD-ISM系統(tǒng)的核心創(chuàng)新在于突破了深層組織超分辨率成像的多個(gè)技術(shù)難題。首先，通過雙共聚焦策略物理性消除離焦信號(hào)，解決了傳統(tǒng)計(jì)算方法導(dǎo)致的信號(hào)失真問題。旋轉(zhuǎn)盤技術(shù)的引入不僅提升了成像對(duì)比度，還保留了原始強(qiáng)度分布，為高保真重建奠定了基礎(chǔ)。其次，動(dòng)態(tài)針孔陣列像素重分配算法克服了理想點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)假設(shè)的局限性，能自適應(yīng)校正斯托克斯位移和光學(xué)像差，實(shí)現(xiàn)近乎理論極限的分辨率提升。此外，數(shù)字微鏡設(shè)備的程序化控制使系統(tǒng)支持多模態(tài)成像，如投影式結(jié)構(gòu)化照明顯微鏡，進(jìn)一步擴(kuò)展了應(yīng)用場(chǎng)景。系統(tǒng)價(jià)值體現(xiàn)在其高通用性上：它兼具高分辨率（橫向144納米、軸向351納米）、大穿透深度（180微米）和高通量能力，適用于從細(xì)胞成像到組織尺度探索的多種生物研究需求。與現(xiàn)有技術(shù)相比，C2SD-ISM在保持高速成像的同時(shí)，顯著降低了光毒性和偽影，為活體動(dòng)態(tài)過程研究提供了新可能。
總結(jié)與展望
C2SD-ISM系統(tǒng)通過集成旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡和數(shù)字微鏡設(shè)備，結(jié)合創(chuàng)新算法，成功實(shí)現(xiàn)了高保真深層組織超分辨率成像。該系統(tǒng)在分辨率、穿透深度和重建保真度方面均表現(xiàn)出色，為生物醫(yī)學(xué)研究提供了強(qiáng)大工具。未來，通過整合自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)可進(jìn)一步校正樣本誘導(dǎo)像差，提升在復(fù)雜生物結(jié)構(gòu)中的成像精度。長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光探針和非線性激發(fā)策略（如雙光子吸收）的引入，有望減少散射和自發(fā)熒光，擴(kuò)展穿透深度。此外，深度學(xué)習(xí)算法的應(yīng)用可優(yōu)化重建過程，降低數(shù)據(jù)采集需求，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)超分辨率成像。C2SD-ISM平臺(tái)的靈活性和可擴(kuò)展性使其在動(dòng)態(tài)生物過程觀測(cè)和大規(guī)模生物研究中具有廣闊前景，有望深化我們對(duì)復(fù)雜生物系統(tǒng)的理解。
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Liang Q, Ren W, Jin B, Qiao L, Ge X, Fu Y, Lv X, Li M, Xi P. High-fidelity tissue super-resolution imaging achieved with confocal2 spinning-disk image scanning microscopy. Light Sci Appl. 2025 Aug 4;14(1):260.
DOI:10.1038/s41377-025-01930-x.
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