劍橋大學(xué)團(tuán)隊(duì)等揭示DNMT3L在胎盤發(fā)育中的DNA甲基化調(diào)控機(jī)制
近日，英國劍橋大學(xué)Courtney W. Hanna團(tuán)隊(duì)和西班牙馬德里自治大學(xué)Vicente Perez-Garcia團(tuán)隊(duì)合作，在Cell Stem Cell雜志發(fā)表題為《Ectopic expression of DNMT3L in human trophoblast stem cells restores features of the placental methylome》的研究論文，研究通過微量全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）、染色質(zhì)免疫共沉淀測序（ChIP-seq）、轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）等揭示了人滋養(yǎng)層干細(xì)胞（hTSCs）的DNA甲基化及其在胎盤發(fā)育中的作用，并證明DNMT3L能夠恢復(fù)hTSCs中胎盤的部分甲基化區(qū)域（PMDs）和調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞分化，為胎盤功能及相關(guān)妊娠疾病的研究提供了新依據(jù)。
標(biāo)題：Ectopic expression of DNMT3L in human trophoblast stem cells restores features
of the placental methylome（人滋養(yǎng)層干細(xì)胞中DNMT3L異位表達(dá)可恢復(fù)胎盤甲基化表征）
發(fā)表時(shí)間：2025年2月6日
發(fā)表期刊：Cell Stem Cell
影響因子：IF20.4/Q1
技術(shù)平臺(tái)：微量WGBS、ChIP-seq、RNA-seq等（易基因金牌技術(shù)）
作者單位：英國劍橋大學(xué)、西班牙馬德里自治大學(xué)
DOI：10.1016/j.stem.2024.12.007
胎盤的DNA甲基化圖譜具有特異性且廣泛存在部分甲基化區(qū)域（PMDs）。胎盤“甲基化組”在哺乳動(dòng)物中高度保守，是許多癌癥鑒定的共有表征，與妊娠并發(fā)癥的關(guān)聯(lián)受到廣泛研究。人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞（hTSCs）為胎盤功能研究提供了巨大潛力，有助于更好理解表觀遺傳特征；然而hTSCs表觀基因組是否能夠模擬原代滋養(yǎng)層細(xì)胞不完全清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，與滋養(yǎng)層外細(xì)胞（Trophectoderm，TE）和第一孕期（孕早期，孕1-12周）滋養(yǎng)層細(xì)胞（Cytotrophoblast，CTBs）相比，hTSCs表現(xiàn)出不典型的甲基化組。無論細(xì)胞來源、氧氣水平還是培養(yǎng)條件如何，hTSCs均顯示出在轉(zhuǎn)錄基因體內(nèi)的局部DNA甲基化，并且完全失去PMDs。與早期人類滋養(yǎng)層細(xì)胞不同，hTSCs的DNMT3L表達(dá)顯著缺失，而小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞中PMDs的建立依賴于DNMT3L。研究證明在hTSCs中異位表達(dá)DNMT3L可以恢復(fù)胎盤PMDs的DNA甲基化，支持DNMT3L在人類早期胚胎發(fā)生過程中滋養(yǎng)層發(fā)育的de novo甲基化保守。
研究方法
樣本收集與處理：從6日齡人類囊胚中收集滋養(yǎng)層外細(xì)胞（TE），并從第一孕期胎盤中分離出滋養(yǎng)層細(xì)胞（CTBs），并培養(yǎng)囊胚（BTS11）和孕早期CTB（CT29）的hTSCs。
DNA甲基化分析：利用微量WGBS技術(shù)，分析TE、CTBs和hTSCs的全基因組DNA甲基化模式。將這些細(xì)胞類型的DNA甲基化圖譜與已發(fā)表的數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較，揭示hTSCs與原代滋養(yǎng)層細(xì)胞之間的差異。
細(xì)胞培養(yǎng)與分化：研究了不同培養(yǎng)條件（如氧氣濃度、培養(yǎng)基類型）對(duì)hTSCs DNA甲基化模式的影響。誘導(dǎo)hTSCs分化為合體滋養(yǎng)層細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞，評(píng)估DNA甲基化模式變化。
DNMT3L過表達(dá)實(shí)驗(yàn)：通過慢病毒介導(dǎo)的DNMT3L過表達(dá)，研究DNMT3L對(duì)hTSCs DNA甲基化模式的影響，特別是對(duì)胎盤PMDs的恢復(fù)作用。并評(píng)估DNMT3L過表達(dá)hTSCs在類器官培養(yǎng)中的分化能力。
ChIP-seq：分析hTSCs中的組蛋白修飾，特別是H3K4me3、H3K36me3和H3K27me3的分布。
基因表達(dá)分析：通過RNA-seq和RT-qPCR技術(shù)檢測hTSCs中的基因表達(dá)水平。
結(jié)果圖形
（1）人滋養(yǎng)層干細(xì)胞（hTSCs）表現(xiàn)出與滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞（TE）和CTBs的差異DNA甲基化特征表征
研究發(fā)現(xiàn)，hTSCs的DNA甲基化模式與TE和CTB存在顯著差異。與TE和CTB相比，hTSCs顯示出較低的DNA甲基化水平，且胎盤特有的部分甲基化區(qū)域（PMDs）缺失，這些PMDs在CTBs中表現(xiàn)為部分甲基化狀態(tài)（20%-60%）。此外，hTSCs的DNA甲基化主要集中在轉(zhuǎn)錄基因體內(nèi)，與基因表達(dá)水平呈正相關(guān)（Figure 1）。這一結(jié)果表明，hTSCs的DNA甲基化模式與原代滋養(yǎng)層細(xì)胞存在顯著差異，可能影響其功能和分化能力。
（B）截圖顯示培養(yǎng)的naive和primed hESCs、來自囊胚的hTSCs（BT-hTSCs，n=1）以及來自第一孕期CTBs的hTSCs（CT-hTSCs，n=1）的DNA甲基化模式，與精子（n=3）、卵母細(xì)胞（N=2）、囊胚（n=1）、滋養(yǎng)層外細(xì)胞（mural TE，n=2）、第一孕期CTBs（n=5）和第三孕期胎兒單核細(xì)胞（3rd Mono，n=3）的生物學(xué)重復(fù)樣本的平均DNA甲基化水平進(jìn)行比較。
（C）左側(cè)散點(diǎn)圖顯示了滋養(yǎng)層外細(xì)胞（mural TE，n=2）與hTSCs（n=2）的常染色體100-CpG窗口的平均DNA甲基化水平，右側(cè)散點(diǎn)圖顯示了第一孕期CTBs（n=5）與hTSCs（n=2）的比較。
（D）豆點(diǎn)圖顯示TE（n=2）、BT-hTSCs（n=1）和CT-hTSCs（n=1）的100-CpG窗口的DNA甲基化水平，與第一孕期CTBs（n=5）進(jìn)行比較，覆蓋范圍從未甲基化區(qū)域（<20%）到部分甲基化區(qū)域（20%-60%）再到高甲基化區(qū)域（>60%）。
（E）箱線圖顯示了hTSCs中H3K4me3（n=5）、H3K36me3（n=2）、H3K27me3（n=3）和H3K9me3（n=3）的組蛋白修飾平均富集水平：H3K4me3（活性標(biāo)記）富集于未甲基化區(qū)域；H3K36me3（轉(zhuǎn)錄相關(guān)）與基因體甲基化共定位；H3K27me3和H3K9me3（抑制性標(biāo)記）在hTSCs的PMDs中富集度低于體內(nèi)CTBs。
（F）截圖顯示了hTSCs（n=3）和第二孕期CTBs（2nd CTB，n=2）的H3K27me3富集（RPKM）水平。圖中還標(biāo)注胎盤PMDs和在CTBs中也富集H3K27me3的PMDs的子集，以及hTSCs和CTBs中的H3K27me3富集區(qū)域。
（2）培養(yǎng)條件對(duì)hTSCs的DNA甲基化模式影響有限
研究發(fā)現(xiàn)，不同的培養(yǎng)條件（如氧氣濃度、培養(yǎng)基類型、3D培養(yǎng)等）對(duì)hTSCs的DNA甲基化模式影響有限。結(jié)果顯示，盡管在某些條件下（如低氧環(huán)境）DNA甲基化水平有輕微變化，但這些變化不足以恢復(fù)胎盤PMDs（Figure 2）。這表明hTSCs的DNA甲基化模式相對(duì)穩(wěn)定，且不易通過常規(guī)培養(yǎng)條件進(jìn)行調(diào)控。
(B) 豆點(diǎn)圖顯示人類卵細(xì)胞（n=2）、精子（n=3）、囊胚（n=1）、滋養(yǎng)層外細(xì)胞（n=2）、naive hESCs（n=1）、轉(zhuǎn)分化hTSCs（tdhTSCs，n=2）、BT-hTSCs（n=1）、CT-hTSCs（n=1）、低氧條件下的2D培養(yǎng)hTSCs（2D low O2，n=2）、滋養(yǎng)層類器官培養(yǎng)基中的2D培養(yǎng)hTSCs（2D TOM，n=2）、作為類器官培養(yǎng)的hTSCs（hTSC-Org，n=2）以及低氧條件下的hTSC-Orgs（n=2）、第一孕期CTBs（n=5）、primed hESCs（n=1）和第三孕期胎兒單核細(xì)胞（3rd Mono，n=3）的常染色體100-CpG窗口平均DNA甲基化水平。
(C) 主成分分析顯示常染色體100-CpG窗口的DNA甲基化，不同技術(shù)重復(fù)和生物學(xué)重復(fù)呈現(xiàn)聚類模式。(D) 截圖顯示每種hTSC條件下的100-CpG窗口的DNA甲基化水平，覆蓋范圍為10號(hào)染色體上的3.7 Mbp區(qū)域。圖中還標(biāo)注第一孕期CTBs中定義的胎盤PMDs。
(E) 箱線圖顯示各樣本中胎盤PMDs的100-CpG窗口的平均DNA甲基化水平。
(F) 箱線圖顯示所有樣本中經(jīng)典印記DMRs（左，不同組織中印記的DMRs）和胎盤特異性印記DMRs（右）的平均DNA甲基化水平。
（3）DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）活性改變可能支持hTSCs中非典型DNA甲基化
研究發(fā)現(xiàn)，hTSCs中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的表達(dá)模式與原代滋養(yǎng)層細(xì)胞不同。hTSCs中DNMT3B表達(dá)較高，而DNMT3A和DNMT3L表達(dá)較低。DNMT3B主要在轉(zhuǎn)錄基因體內(nèi)發(fā)揮作用，這與hTSCs中DNA甲基化的基因體定位一致。通過單細(xì)胞RNA測序分析，研究者發(fā)現(xiàn)hTSCs的DNMT表達(dá)模式與早期胚胎發(fā)育中的滋養(yǎng)層細(xì)胞相似，但DNMT3L表達(dá)缺失。這表明DNMT3L缺失可能是hTSCs中DNA甲基化模式異常的主要原因。
圖3：hTSCs中的DNA甲基化富集在具有H3K36me3標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄基因體中，并與DNMT3B表達(dá)相關(guān)。
(A) hTSCs中平均DNA甲基化（n=2）、H3K36me3富集（n=2）和基因表達(dá)（n=5）截圖。
(B) 箱線圖顯示hTSCs中基因表達(dá)水平的十等分位的基因DNA甲基化水平。
(C) 箱線圖顯示hTSCs中基因表達(dá)水平的十等分位的基因H3K36me3水平。
(D) 箱線圖顯示hTSCs（n=5）中DNMT3A、3B和3L的mRNA表達(dá)水平。
(E) UMAP圖顯示來自人類胚胎和干細(xì)胞的單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)，按細(xì)胞類型著色。
(F) UMAP圖（E）上顯示了NMT3A、3B和3L的表達(dá)水平。
（4）在hTSCs中異位表達(dá)DNMT3L可恢復(fù)胎盤PMDs
通過慢病毒介導(dǎo)的DNMT3L過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，研究者發(fā)現(xiàn)DNMT3L的異位表達(dá)能夠顯著恢復(fù)hTSCs中的胎盤PMDs。與對(duì)照組相比，DNMT3L過表達(dá)的hTSCs顯示出更高的DNA甲基化水平，特別是在PMDs區(qū)域。此外，DNMT3L過表達(dá)還恢復(fù)了H3K27me3標(biāo)記的CpG島和印記區(qū)域的中間甲基化水平。這表明DNMT3L在胎盤PMDs的建立中起著關(guān)鍵作用。
圖4：DNMT3L異位表達(dá)可恢復(fù)胎盤PMD
(A) hTSCs中DNMT3L慢病毒表達(dá)系統(tǒng)示意圖，展示載體設(shè)計(jì)（上）和用于獲得穩(wěn)定表達(dá)DNMT3L的hTSCs以及轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)照細(xì)胞（下）的實(shí)驗(yàn)流程。
(B) 對(duì)照（Stuffer）細(xì)胞和DNMT3L過表達(dá)（DNMT3L-OE）hTSCs的DNMT3L表達(dá)RT-qPCR分析。
(C) Western blot分析顯示對(duì)照組與DNMT3L-OE hTSCs中的DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L和TUBULIN，證實(shí)DNMT3L在DNMT3L-OE hTSCs中的表達(dá)。
(D) 主成分分析顯示基于常染色體100-CpG窗口的DNA甲基化，揭示DNMT3L-OE hTSCs與第一孕期CTBs最為接近。
(E) BT-hTSCs（n=1）、CT-hTSCs（n=1）、對(duì)照hTSCs（n=3實(shí)驗(yàn)重復(fù)）和DNMT3L-OE hTSCs（n=3實(shí)驗(yàn)重復(fù)）中胎盤PMDs內(nèi)100-CpG窗口與第一孕期CTBs（n=5）比較的平均DNA甲基化水平箱線圖。
(F) T-hTSCs、CT-hTSCs、對(duì)照hTSCs、DNMT3L-OE hTSCs和第一孕期CTBs中3號(hào)染色體3.7 Mbp區(qū)域的100-CpG窗口的平均DNA甲基化水平截圖，特別是在PMDs內(nèi)DNA甲基化水平增加。圖中還標(biāo)注在第二孕期CTBs或hTSCs中定義的H3K27me3區(qū)域、在第一孕期CTBs中定義的胎盤PMDs以及與對(duì)照組相比DNMT3L-OE中高甲基化的差異甲基化區(qū)域（DMRs）。
5. DNMT3L過表達(dá)的hTSCs具有相似自我更新能力，但在類器官培養(yǎng)中分化能力受損
DNMT3L過表達(dá)的hTSCs在2D培養(yǎng)中顯示出與對(duì)照組相似的自我更新能力，但在3D類器官培養(yǎng)中，其分化為合體滋養(yǎng)層細(xì)胞（STBs）的能力受到抑制。研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3L過表達(dá)的hTSCs在類器官培養(yǎng)中表現(xiàn)出CREB蛋白水平降低和CREB激活減少，這可能與CRE序列基序的超甲基化、CREB蛋白水平降低以及STB分化相關(guān)的信號(hào)通路受損有關(guān)。這一結(jié)果表明，DNMT3L的持續(xù)表達(dá)可能影響hTSCs的分化能力，特別是在STBs的形成過程中。
(B) 條形圖顯示對(duì)照hTSCs和DNMT3L-OE中干細(xì)胞標(biāo)記物TEAD4、TP63、GATA3和ELF5（上）以及上皮細(xì)胞標(biāo)記物CDH1、EPCAM、TJP1和VCL（下）的相對(duì)表達(dá)水平RT-qPCR。
(C) 熱圖顯示hESC基因OCT4（POU5F1）和NANOG以及hTSC基因ELF5的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)100-CpG窗口的DNA甲基化。展示primed hESCs（n=1）、naive hESCs（n=1）、tdhTSCs（n=2）、BT-hTSCs（n=1）、CT-hTSCs（n=1）、低氧條件下2D培養(yǎng)的hTSCs（n=2）、TOM（2D TOM）中的hTSCs（n=2）、hTSC-Org（n=2）以及低氧條件下的hTSC-Orgs（n=2）、對(duì)照hTSCs（n=3實(shí)驗(yàn)重復(fù)）和DNMT3L-OE hTSCs（n=3實(shí)驗(yàn)重復(fù)）的平均值。
(D) 直方圖展示DNMT3L-OE和對(duì)照hTSCs、JEG3細(xì)胞（陽性對(duì)照）以及陰性對(duì)照中HLA-G、HLA-C、HLA-A2和泛HLA-A,B,C的表達(dá)情況。
圖6：在類器官培養(yǎng)中，DNMT3L過表達(dá)hTSCs無法有效分化為合體滋養(yǎng)層細(xì)胞
(A) 示意圖展示在hTSCs中誘導(dǎo)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞（STB）形成的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。具體而言，STB分化可以通過2D培養(yǎng)中的FRSK（I）或類器官培養(yǎng)來模擬體內(nèi)分化（II），這通過GPCR激活實(shí)現(xiàn)，據(jù)推測包括hCG與其受體LHCGR的結(jié)合。腺苷酸環(huán)化酶（AC）的活通過將ATP轉(zhuǎn)化為cAMP來誘導(dǎo)STB分化，激活蛋白激酶A（PKA），進(jìn)而激活MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終通過磷酸化激活CREB和ATF-1轉(zhuǎn)錄因子（TF），并結(jié)合到cAMP反應(yīng)元件（CREs，紅色DNA基序）。CRE motif的DNA甲基化會(huì)阻斷CREB:ATF-1的結(jié)合，而DNMT表達(dá)的缺失被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致CRE motif的非甲基化。由MAPK激活的對(duì)甲基化不敏感轉(zhuǎn)錄因子（藍(lán)色）可以結(jié)合到目標(biāo)motif。
(B) 免疫熒光圖像顯示與對(duì)照hTSC類器官相比，DNMT3L-OE hTSC類器官中的CDH1和SDC1。
(C) 條形圖顯示DNMT3L-OE和對(duì)照hTSC類器官中STB面積相對(duì)于總類器官面積的比例。
(D) western blot顯示與對(duì)照組相比，DNMT3L-OE hTSC類器官中的HSP90、DNMT3L、pCREB（Ser133）、pATF-1和總CREB豐度。左側(cè)圖表顯示CREB條帶強(qiáng)度的定量。與對(duì)照組相比，DNMT3L-OE hTSC類器官顯示出CREB蛋白水平的降低。
(E) 免疫熒光圖像顯示了對(duì)照和DNMT3L-OE hTSC類器官中的pCREB和SDC1。
(F) 顯示了被ATF-1結(jié)合的經(jīng)典CRE motif，其中包含一個(gè)中心CpG位點(diǎn)。
(G) 條形圖顯示通過RT-qPCR檢測DNMT3L-OE和對(duì)照hTSC類器官中上皮細(xì)胞標(biāo)記物CDH1和STB標(biāo)記物SDC1、GCM1、CGB、CGA、ERVW-1（SYNCYTIN-1）以及ERVFRD-1（SYNCYTIN-2）的相對(duì)表達(dá)。
結(jié)論和啟示
本研究揭示了hTSCs的DNA甲基化模式與原代滋養(yǎng)層細(xì)胞的顯著差異，并通過DNMT3L的異位表達(dá)恢復(fù)了胎盤PMDs。研究結(jié)果表明，DNMT3L在胎盤PMDs的建立中起著關(guān)鍵作用，而其在hTSCs中的缺失可能是導(dǎo)致DNA甲基化模式異常的主要原因。此外，DNMT3L過表達(dá)的hTSCs在類器官培養(yǎng)中表現(xiàn)出分化能力受損，這可能與CREB結(jié)合位點(diǎn)的DNA甲基化增加有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為理解胎盤發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控提供了重要信息，并為研究胎盤相關(guān)疾病提供了新的模型和方法。
微量WGBS技術(shù)的作用
微量WGBS技術(shù)在本研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。它允許研究者對(duì)少量細(xì)胞樣本進(jìn)行全基因組DNA甲基化分析，揭示了hTSCs與原代滋養(yǎng)層細(xì)胞之間的DNA甲基化差異。這一技術(shù)的應(yīng)用不僅提高了研究的分辨率，還為研究胎盤發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控提供了新的工具。未來，類似的研究可以利用微量WGBS技術(shù)，深入探索其他細(xì)胞類型和組織的DNA甲基化模式，揭示其在發(fā)育和疾病中的作用。
參考文獻(xiàn)：
Lea G, Doria-Borrell P, Ferrero-Micó A, Varma A, Simon C, Anderson H, Biggins L, De Clercq K, Andrews S, Niakan KK, Gahurova L, McGovern N, Pérez-García V, Hanna CW. Ectopic expression of DNMT3L in human trophoblast stem cells restores features of the placental methylome. Cell Stem Cell. 2024 Dec 31. doi: 10.1016/j.stem.2024.12.007.
標(biāo)題：Ectopic expression of DNMT3L in human trophoblast stem cells restores features
of the placental methylome（人滋養(yǎng)層干細(xì)胞中DNMT3L異位表達(dá)可恢復(fù)胎盤甲基化表征）
發(fā)表期刊：Cell Stem Cell
影響因子：IF20.4/Q1
技術(shù)平臺(tái)：微量WGBS、ChIP-seq、RNA-seq等（易基因金牌技術(shù)）
作者單位：英國劍橋大學(xué)、西班牙馬德里自治大學(xué)
DOI：10.1016/j.stem.2024.12.007
胎盤的DNA甲基化圖譜具有特異性且廣泛存在部分甲基化區(qū)域（PMDs）。胎盤“甲基化組”在哺乳動(dòng)物中高度保守，是許多癌癥鑒定的共有表征，與妊娠并發(fā)癥的關(guān)聯(lián)受到廣泛研究。人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞（hTSCs）為胎盤功能研究提供了巨大潛力，有助于更好理解表觀遺傳特征；然而hTSCs表觀基因組是否能夠模擬原代滋養(yǎng)層細(xì)胞不完全清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，與滋養(yǎng)層外細(xì)胞（Trophectoderm，TE）和第一孕期（孕早期，孕1-12周）滋養(yǎng)層細(xì)胞（Cytotrophoblast，CTBs）相比，hTSCs表現(xiàn)出不典型的甲基化組。無論細(xì)胞來源、氧氣水平還是培養(yǎng)條件如何，hTSCs均顯示出在轉(zhuǎn)錄基因體內(nèi)的局部DNA甲基化，并且完全失去PMDs。與早期人類滋養(yǎng)層細(xì)胞不同，hTSCs的DNMT3L表達(dá)顯著缺失，而小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞中PMDs的建立依賴于DNMT3L。研究證明在hTSCs中異位表達(dá)DNMT3L可以恢復(fù)胎盤PMDs的DNA甲基化，支持DNMT3L在人類早期胚胎發(fā)生過程中滋養(yǎng)層發(fā)育的de novo甲基化保守。
- hTSCs與第一孕期滋養(yǎng)層細(xì)胞（1st CTBs）相比，在胎盤PMDs區(qū)域表現(xiàn)出低甲基化。
- 細(xì)胞來源和培養(yǎng)條件對(duì)hTSCs的DNA甲基化模式作用有限。
- DNMT3L在人類滋養(yǎng)層細(xì)胞的de novo甲基化可能窗口期間表達(dá)。
- 在hTSCs中異位表達(dá)DNMT3L可恢復(fù)胎盤PMDs的DNA甲基化。
圖形摘要
研究方法
樣本收集與處理：從6日齡人類囊胚中收集滋養(yǎng)層外細(xì)胞（TE），并從第一孕期胎盤中分離出滋養(yǎng)層細(xì)胞（CTBs），并培養(yǎng)囊胚（BTS11）和孕早期CTB（CT29）的hTSCs。
DNA甲基化分析：利用微量WGBS技術(shù)，分析TE、CTBs和hTSCs的全基因組DNA甲基化模式。將這些細(xì)胞類型的DNA甲基化圖譜與已發(fā)表的數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較，揭示hTSCs與原代滋養(yǎng)層細(xì)胞之間的差異。
細(xì)胞培養(yǎng)與分化：研究了不同培養(yǎng)條件（如氧氣濃度、培養(yǎng)基類型）對(duì)hTSCs DNA甲基化模式的影響。誘導(dǎo)hTSCs分化為合體滋養(yǎng)層細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞，評(píng)估DNA甲基化模式變化。
DNMT3L過表達(dá)實(shí)驗(yàn)：通過慢病毒介導(dǎo)的DNMT3L過表達(dá)，研究DNMT3L對(duì)hTSCs DNA甲基化模式的影響，特別是對(duì)胎盤PMDs的恢復(fù)作用。并評(píng)估DNMT3L過表達(dá)hTSCs在類器官培養(yǎng)中的分化能力。
ChIP-seq：分析hTSCs中的組蛋白修飾，特別是H3K4me3、H3K36me3和H3K27me3的分布。
基因表達(dá)分析：通過RNA-seq和RT-qPCR技術(shù)檢測hTSCs中的基因表達(dá)水平。
結(jié)果圖形
（1）人滋養(yǎng)層干細(xì)胞（hTSCs）表現(xiàn)出與滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞（TE）和CTBs的差異DNA甲基化特征表征
研究發(fā)現(xiàn)，hTSCs的DNA甲基化模式與TE和CTB存在顯著差異。與TE和CTB相比，hTSCs顯示出較低的DNA甲基化水平，且胎盤特有的部分甲基化區(qū)域（PMDs）缺失，這些PMDs在CTBs中表現(xiàn)為部分甲基化狀態(tài)（20%-60%）。此外，hTSCs的DNA甲基化主要集中在轉(zhuǎn)錄基因體內(nèi)，與基因表達(dá)水平呈正相關(guān)（Figure 1）。這一結(jié)果表明，hTSCs的DNA甲基化模式與原代滋養(yǎng)層細(xì)胞存在顯著差異，可能影響其功能和分化能力。
圖1：與體內(nèi)細(xì)胞類型相比，hTSCs表現(xiàn)出特異性DNA甲基化譜
（A）基于常染色體100-CpG窗口的DNA甲基化數(shù)據(jù)，生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)樣本聚集模式的主成分分析。hTSCs的甲基化譜與TE和1st CTB均不重疊，表明其甲基化圖譜具有特異性。（B）截圖顯示培養(yǎng)的naive和primed hESCs、來自囊胚的hTSCs（BT-hTSCs，n=1）以及來自第一孕期CTBs的hTSCs（CT-hTSCs，n=1）的DNA甲基化模式，與精子（n=3）、卵母細(xì)胞（N=2）、囊胚（n=1）、滋養(yǎng)層外細(xì)胞（mural TE，n=2）、第一孕期CTBs（n=5）和第三孕期胎兒單核細(xì)胞（3rd Mono，n=3）的生物學(xué)重復(fù)樣本的平均DNA甲基化水平進(jìn)行比較。
（C）左側(cè)散點(diǎn)圖顯示了滋養(yǎng)層外細(xì)胞（mural TE，n=2）與hTSCs（n=2）的常染色體100-CpG窗口的平均DNA甲基化水平，右側(cè)散點(diǎn)圖顯示了第一孕期CTBs（n=5）與hTSCs（n=2）的比較。
（D）豆點(diǎn)圖顯示TE（n=2）、BT-hTSCs（n=1）和CT-hTSCs（n=1）的100-CpG窗口的DNA甲基化水平，與第一孕期CTBs（n=5）進(jìn)行比較，覆蓋范圍從未甲基化區(qū)域（<20%）到部分甲基化區(qū)域（20%-60%）再到高甲基化區(qū)域（>60%）。
（E）箱線圖顯示了hTSCs中H3K4me3（n=5）、H3K36me3（n=2）、H3K27me3（n=3）和H3K9me3（n=3）的組蛋白修飾平均富集水平：H3K4me3（活性標(biāo)記）富集于未甲基化區(qū)域；H3K36me3（轉(zhuǎn)錄相關(guān)）與基因體甲基化共定位；H3K27me3和H3K9me3（抑制性標(biāo)記）在hTSCs的PMDs中富集度低于體內(nèi)CTBs。
（F）截圖顯示了hTSCs（n=3）和第二孕期CTBs（2nd CTB，n=2）的H3K27me3富集（RPKM）水平。圖中還標(biāo)注胎盤PMDs和在CTBs中也富集H3K27me3的PMDs的子集，以及hTSCs和CTBs中的H3K27me3富集區(qū)域。
（2）培養(yǎng)條件對(duì)hTSCs的DNA甲基化模式影響有限
研究發(fā)現(xiàn)，不同的培養(yǎng)條件（如氧氣濃度、培養(yǎng)基類型、3D培養(yǎng)等）對(duì)hTSCs的DNA甲基化模式影響有限。結(jié)果顯示，盡管在某些條件下（如低氧環(huán)境）DNA甲基化水平有輕微變化，但這些變化不足以恢復(fù)胎盤PMDs（Figure 2）。這表明hTSCs的DNA甲基化模式相對(duì)穩(wěn)定，且不易通過常規(guī)培養(yǎng)條件進(jìn)行調(diào)控。
圖2：不同細(xì)胞來源、培養(yǎng)條件和氧濃度均未能恢復(fù)胎盤甲基化表征
(A) 示意圖展示hTSCs的不同來源，包括囊胚來源①、細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞來源②以及從naive hESCs轉(zhuǎn)分化而來③，以及本研究中使用的培養(yǎng)方法。(B) 豆點(diǎn)圖顯示人類卵細(xì)胞（n=2）、精子（n=3）、囊胚（n=1）、滋養(yǎng)層外細(xì)胞（n=2）、naive hESCs（n=1）、轉(zhuǎn)分化hTSCs（tdhTSCs，n=2）、BT-hTSCs（n=1）、CT-hTSCs（n=1）、低氧條件下的2D培養(yǎng)hTSCs（2D low O2，n=2）、滋養(yǎng)層類器官培養(yǎng)基中的2D培養(yǎng)hTSCs（2D TOM，n=2）、作為類器官培養(yǎng)的hTSCs（hTSC-Org，n=2）以及低氧條件下的hTSC-Orgs（n=2）、第一孕期CTBs（n=5）、primed hESCs（n=1）和第三孕期胎兒單核細(xì)胞（3rd Mono，n=3）的常染色體100-CpG窗口平均DNA甲基化水平。
(C) 主成分分析顯示常染色體100-CpG窗口的DNA甲基化，不同技術(shù)重復(fù)和生物學(xué)重復(fù)呈現(xiàn)聚類模式。(D) 截圖顯示每種hTSC條件下的100-CpG窗口的DNA甲基化水平，覆蓋范圍為10號(hào)染色體上的3.7 Mbp區(qū)域。圖中還標(biāo)注第一孕期CTBs中定義的胎盤PMDs。
(E) 箱線圖顯示各樣本中胎盤PMDs的100-CpG窗口的平均DNA甲基化水平。
(F) 箱線圖顯示所有樣本中經(jīng)典印記DMRs（左，不同組織中印記的DMRs）和胎盤特異性印記DMRs（右）的平均DNA甲基化水平。
（3）DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）活性改變可能支持hTSCs中非典型DNA甲基化
研究發(fā)現(xiàn)，hTSCs中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的表達(dá)模式與原代滋養(yǎng)層細(xì)胞不同。hTSCs中DNMT3B表達(dá)較高，而DNMT3A和DNMT3L表達(dá)較低。DNMT3B主要在轉(zhuǎn)錄基因體內(nèi)發(fā)揮作用，這與hTSCs中DNA甲基化的基因體定位一致。通過單細(xì)胞RNA測序分析，研究者發(fā)現(xiàn)hTSCs的DNMT表達(dá)模式與早期胚胎發(fā)育中的滋養(yǎng)層細(xì)胞相似，但DNMT3L表達(dá)缺失。這表明DNMT3L缺失可能是hTSCs中DNA甲基化模式異常的主要原因。
圖3：hTSCs中的DNA甲基化富集在具有H3K36me3標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄基因體中，并與DNMT3B表達(dá)相關(guān)。
(B) 箱線圖顯示hTSCs中基因表達(dá)水平的十等分位的基因DNA甲基化水平。
(C) 箱線圖顯示hTSCs中基因表達(dá)水平的十等分位的基因H3K36me3水平。
(D) 箱線圖顯示hTSCs（n=5）中DNMT3A、3B和3L的mRNA表達(dá)水平。
(E) UMAP圖顯示來自人類胚胎和干細(xì)胞的單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)，按細(xì)胞類型著色。
(F) UMAP圖（E）上顯示了NMT3A、3B和3L的表達(dá)水平。
（4）在hTSCs中異位表達(dá)DNMT3L可恢復(fù)胎盤PMDs
通過慢病毒介導(dǎo)的DNMT3L過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，研究者發(fā)現(xiàn)DNMT3L的異位表達(dá)能夠顯著恢復(fù)hTSCs中的胎盤PMDs。與對(duì)照組相比，DNMT3L過表達(dá)的hTSCs顯示出更高的DNA甲基化水平，特別是在PMDs區(qū)域。此外，DNMT3L過表達(dá)還恢復(fù)了H3K27me3標(biāo)記的CpG島和印記區(qū)域的中間甲基化水平。這表明DNMT3L在胎盤PMDs的建立中起著關(guān)鍵作用。
圖4：DNMT3L異位表達(dá)可恢復(fù)胎盤PMD
(B) 對(duì)照（Stuffer）細(xì)胞和DNMT3L過表達(dá)（DNMT3L-OE）hTSCs的DNMT3L表達(dá)RT-qPCR分析。
(C) Western blot分析顯示對(duì)照組與DNMT3L-OE hTSCs中的DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L和TUBULIN，證實(shí)DNMT3L在DNMT3L-OE hTSCs中的表達(dá)。
(D) 主成分分析顯示基于常染色體100-CpG窗口的DNA甲基化，揭示DNMT3L-OE hTSCs與第一孕期CTBs最為接近。
(E) BT-hTSCs（n=1）、CT-hTSCs（n=1）、對(duì)照hTSCs（n=3實(shí)驗(yàn)重復(fù)）和DNMT3L-OE hTSCs（n=3實(shí)驗(yàn)重復(fù)）中胎盤PMDs內(nèi)100-CpG窗口與第一孕期CTBs（n=5）比較的平均DNA甲基化水平箱線圖。
(F) T-hTSCs、CT-hTSCs、對(duì)照hTSCs、DNMT3L-OE hTSCs和第一孕期CTBs中3號(hào)染色體3.7 Mbp區(qū)域的100-CpG窗口的平均DNA甲基化水平截圖，特別是在PMDs內(nèi)DNA甲基化水平增加。圖中還標(biāo)注在第二孕期CTBs或hTSCs中定義的H3K27me3區(qū)域、在第一孕期CTBs中定義的胎盤PMDs以及與對(duì)照組相比DNMT3L-OE中高甲基化的差異甲基化區(qū)域（DMRs）。
5. DNMT3L過表達(dá)的hTSCs具有相似自我更新能力，但在類器官培養(yǎng)中分化能力受損
DNMT3L過表達(dá)的hTSCs在2D培養(yǎng)中顯示出與對(duì)照組相似的自我更新能力，但在3D類器官培養(yǎng)中，其分化為合體滋養(yǎng)層細(xì)胞（STBs）的能力受到抑制。研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3L過表達(dá)的hTSCs在類器官培養(yǎng)中表現(xiàn)出CREB蛋白水平降低和CREB激活減少，這可能與CRE序列基序的超甲基化、CREB蛋白水平降低以及STB分化相關(guān)的信號(hào)通路受損有關(guān)。這一結(jié)果表明，DNMT3L的持續(xù)表達(dá)可能影響hTSCs的分化能力，特別是在STBs的形成過程中。
圖5：DNMT3L過表達(dá)（DNMT3L-OE）hTSCs在自我更新和細(xì)胞身份上與對(duì)照hTSCs相似
(A) 圖像顯示DNMT3L過表達(dá)（DNMT3L-OE）與對(duì)照hTSCs相似的細(xì)胞形態(tài)。(B) 條形圖顯示對(duì)照hTSCs和DNMT3L-OE中干細(xì)胞標(biāo)記物TEAD4、TP63、GATA3和ELF5（上）以及上皮細(xì)胞標(biāo)記物CDH1、EPCAM、TJP1和VCL（下）的相對(duì)表達(dá)水平RT-qPCR。
(C) 熱圖顯示hESC基因OCT4（POU5F1）和NANOG以及hTSC基因ELF5的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)100-CpG窗口的DNA甲基化。展示primed hESCs（n=1）、naive hESCs（n=1）、tdhTSCs（n=2）、BT-hTSCs（n=1）、CT-hTSCs（n=1）、低氧條件下2D培養(yǎng)的hTSCs（n=2）、TOM（2D TOM）中的hTSCs（n=2）、hTSC-Org（n=2）以及低氧條件下的hTSC-Orgs（n=2）、對(duì)照hTSCs（n=3實(shí)驗(yàn)重復(fù)）和DNMT3L-OE hTSCs（n=3實(shí)驗(yàn)重復(fù)）的平均值。
(D) 直方圖展示DNMT3L-OE和對(duì)照hTSCs、JEG3細(xì)胞（陽性對(duì)照）以及陰性對(duì)照中HLA-G、HLA-C、HLA-A2和泛HLA-A,B,C的表達(dá)情況。
圖6：在類器官培養(yǎng)中，DNMT3L過表達(dá)hTSCs無法有效分化為合體滋養(yǎng)層細(xì)胞
(B) 免疫熒光圖像顯示與對(duì)照hTSC類器官相比，DNMT3L-OE hTSC類器官中的CDH1和SDC1。
(C) 條形圖顯示DNMT3L-OE和對(duì)照hTSC類器官中STB面積相對(duì)于總類器官面積的比例。
(D) western blot顯示與對(duì)照組相比，DNMT3L-OE hTSC類器官中的HSP90、DNMT3L、pCREB（Ser133）、pATF-1和總CREB豐度。左側(cè)圖表顯示CREB條帶強(qiáng)度的定量。與對(duì)照組相比，DNMT3L-OE hTSC類器官顯示出CREB蛋白水平的降低。
(E) 免疫熒光圖像顯示了對(duì)照和DNMT3L-OE hTSC類器官中的pCREB和SDC1。
(F) 顯示了被ATF-1結(jié)合的經(jīng)典CRE motif，其中包含一個(gè)中心CpG位點(diǎn)。
(G) 條形圖顯示通過RT-qPCR檢測DNMT3L-OE和對(duì)照hTSC類器官中上皮細(xì)胞標(biāo)記物CDH1和STB標(biāo)記物SDC1、GCM1、CGB、CGA、ERVW-1（SYNCYTIN-1）以及ERVFRD-1（SYNCYTIN-2）的相對(duì)表達(dá)。
結(jié)論和啟示
本研究揭示了hTSCs的DNA甲基化模式與原代滋養(yǎng)層細(xì)胞的顯著差異，并通過DNMT3L的異位表達(dá)恢復(fù)了胎盤PMDs。研究結(jié)果表明，DNMT3L在胎盤PMDs的建立中起著關(guān)鍵作用，而其在hTSCs中的缺失可能是導(dǎo)致DNA甲基化模式異常的主要原因。此外，DNMT3L過表達(dá)的hTSCs在類器官培養(yǎng)中表現(xiàn)出分化能力受損，這可能與CREB結(jié)合位點(diǎn)的DNA甲基化增加有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為理解胎盤發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控提供了重要信息，并為研究胎盤相關(guān)疾病提供了新的模型和方法。
微量WGBS技術(shù)的作用
微量WGBS技術(shù)在本研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。它允許研究者對(duì)少量細(xì)胞樣本進(jìn)行全基因組DNA甲基化分析，揭示了hTSCs與原代滋養(yǎng)層細(xì)胞之間的DNA甲基化差異。這一技術(shù)的應(yīng)用不僅提高了研究的分辨率，還為研究胎盤發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控提供了新的工具。未來，類似的研究可以利用微量WGBS技術(shù)，深入探索其他細(xì)胞類型和組織的DNA甲基化模式，揭示其在發(fā)育和疾病中的作用。
參考文獻(xiàn)：
Lea G, Doria-Borrell P, Ferrero-Micó A, Varma A, Simon C, Anderson H, Biggins L, De Clercq K, Andrews S, Niakan KK, Gahurova L, McGovern N, Pérez-García V, Hanna CW. Ectopic expression of DNMT3L in human trophoblast stem cells restores features of the placental methylome. Cell Stem Cell. 2024 Dec 31. doi: 10.1016/j.stem.2024.12.007.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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