in vivo CAR T（體內CAR-T）進行概念驗證的技術方案

2025 年 9 月 17 日，首次使用 mRNA-LNP 的  in vivo CAR-T臨床研究結果在NEJM發(fā)表（In Vivo CD19 CAR T-Cell Therapy for Refractory Systemic Lupus Erythematosus），初步實現(xiàn)了LNP途徑的人體概念驗證；

圖.2025 年 9 月 17 日NEJM

這里分享一篇靶向CD3/CD7的tLNP  in vivo CAR-T驗證思路和內容：

1.首先是轉染效率，對比了靜息狀態(tài)和預激活狀態(tài)T細胞的轉染情況，結果是雙靶向tLNP-CD7/CD3在靜息T細胞和預激活T細胞中均表現(xiàn)出最高的轉染效率（這里發(fā)現(xiàn)雖然tLNP-CD7無法促進mcDNA遞送至靜息T細胞，但它能夠高效轉染激活T細胞，比tLNP-CD3還高）；

圖1.轉染效率對比

2.其次是靶向效應，看下靶向T細胞的特異性（c圖顯示所有PBMC里T細胞的攝取明顯升高，d圖顯示單獨的CD3 靶向明顯不如增加CD7的表達特異性強）；這里關注到非靶向LNP在各個PBMC亞群中也有攝取和mRNA表達，還有在LNP中靶向CD7的同時也增強了NK細胞的攝取和mRNA表達；

圖2.靶向對比

3.基于上面的基礎，作者開發(fā)了共同遞送編碼CAR的mcDNA和SB100x轉座酶mRNA，實現(xiàn)穩(wěn)定的體內CAR-T工程；

圖3.設計成品展示

4.接下來就是測試產(chǎn)品的表達穩(wěn)定性，殺傷及效靶比，作者開發(fā)了共同遞送編碼CAR的mcDNA和SB100x轉座酶mRNA，實現(xiàn)穩(wěn)定的體內CAR-T表達及殺傷；

圖4.產(chǎn)品體外測試

5.動物實驗部分作者使用了人源化小鼠腫瘤模型（Nalm6-luci腫瘤細胞）；藥效測試時提前一周接種腫瘤細胞（接種量是5×10^5），48h后進行PBMC移植（人源化5×10^6），5天后進行靜脈給藥（模型的給藥窗口4周左右，給藥組有1只17天死于麻醉，實驗人員也不想呀），給藥后21天外周血CART達到峰值，終點時骨髓和脾臟均有24%的表達量，腫瘤抑制作用明顯。

在做劑量探索時先提前11天進行人源化接種（PBMC移植5×10^6），注射前8天接種腫瘤細胞（接種量是5×10^5）（這點改動值得討論，細心的讀者能發(fā)現(xiàn)），低劑量探索發(fā)現(xiàn)40 µg/kg或（4 µg/kg）依然能對腫瘤細胞有抑制作用，其中40ug/kg抑制作用更明顯。

作者補充材料中也做了雙靶點CD19 和 CD22 CAR（NCtx-dual）的研究和小鼠模型測試，均能展現(xiàn)出明顯的腫瘤抑制作用；50 µg/kg 劑量的 NCtx-dual 外周血CART細胞增殖達50,000 /µL；

圖5.產(chǎn)品體內測試

6.為了更進一步模擬人體環(huán)境，作者使用了人類 CD34+ 造血干細胞移植的 NCG 小鼠模型 (NCG-His)；該模型更貼合人類免疫細胞群的發(fā)育，且不會像在 PBMC 移植小鼠中那樣快速發(fā)生GVHD。

這次直接測試雙靶點CD19 和 CD22 CAR（NCtx-dual）劑量50 µg/kg，給藥前2天接種腫瘤細胞（接種量是5×10^5），24h后進行 200 ng IL-7腹腔注射。

治療組共12只小鼠，至給藥后42天有7只完全緩解，而對照組動物均在Day28天死亡；

這次作者檢測了T細胞(PD-1的表達，未發(fā)現(xiàn)明顯的 CAR T 細胞耗竭跡象；基于CD45RA 和 CD62L表達的 T 細胞分化分析顯示到第40天轉變?yōu)榉只�程度更低更有利于完全緩解和持久性的TCM表型。

圖6.產(chǎn)品體內測試Plus