ChIP-seq等揭示大豆開(kāi)花時(shí)間調(diào)控及區(qū)域適應(yīng)性的表觀分子機(jī)制
近日，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王應(yīng)祥課題組和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院楊存義課題組合作探究了大豆開(kāi)花進(jìn)程的調(diào)控機(jī)制，特別是組蛋白去甲基化酶GmLDL2（Lysine-specific demethylase like 2）在大豆適應(yīng)低緯度地區(qū)中的作用。具體而言，研究者通過(guò)篩選早花突變體ef1并鑒定其因果基因GmLDL2，結(jié)合ChIP-seq和RNA-seq等分析，揭示了GmLDL2通過(guò)直接調(diào)控下游靶基因GmFER（擬南芥FERONIA直系同源物）的表達(dá)來(lái)調(diào)控大豆開(kāi)花進(jìn)程，進(jìn)而影響大豆在不同緯度地區(qū)的適應(yīng)性。這一發(fā)現(xiàn)為通過(guò)分子設(shè)計(jì)育種改善大豆區(qū)域適應(yīng)性提供了重要的理論基礎(chǔ)和潛在靶點(diǎn)。相關(guān)研究成果以“Natural variation in histone demethylase GmLDL2 confers flowering time divergence for geographical expansion in soybean”為題發(fā)表于《Nature Communications》（自然通訊）。
標(biāo)題：Natural variation in histone demethylase GmLDL2 confers flowering time divergence for geographical expansion in soybean（組蛋白去甲基化酶GmLDL2自然變異調(diào)控大豆開(kāi)花時(shí)間分化和地理適應(yīng)性）
發(fā)表時(shí)間：2025年7月1日
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：IF15.7/Q1
技術(shù)平臺(tái)：ChIP-seq、RNA-seq等（易基因金牌技術(shù)）
作者單位：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
DOI：10.1038/s41467-025-61328-6
在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間開(kāi)花是決定大豆區(qū)域適應(yīng)性和產(chǎn)量的關(guān)鍵性狀之一。此前，盡管已在大豆中鑒定出幾個(gè)調(diào)控開(kāi)花時(shí)間的關(guān)鍵基因，但相關(guān)表觀遺傳調(diào)控因子尚不完全清楚。本研究鑒定出一個(gè)早花突變體（ef1），并克隆其“因果”基因GmLDL2。其中，酶活性實(shí)驗(yàn)表明，GmLDL2對(duì)H3K4me1和H3K4me2（H3K4me1/2）具有去甲基化活性。ChIP-seq和RNA-seq整合分析表明，GmLDL2直接抑制大豆FERONIA同源基因GmFER表達(dá)。遺傳分析揭示GmLDL2以GmFER依賴(lài)性方式調(diào)控大豆開(kāi)花。GmLDL2兩種單倍型GmLDL2H1和GmLDL2H2表現(xiàn)出差異去甲基化活性，可能分別促進(jìn)大豆對(duì)低緯度和高緯度地區(qū)適應(yīng)性。總之，本研究發(fā)現(xiàn)揭示了GmLDL2-GmFER模塊在調(diào)控大豆開(kāi)花中的作用，并為改良大豆的區(qū)域適應(yīng)性補(bǔ)充了關(guān)鍵信息。
圖形摘要：GmLDL2在調(diào)控大豆開(kāi)花時(shí)間和提高低緯度適應(yīng)性中的作用模型
在自然選擇下，GmLDL2H1等位基因促進(jìn)大豆在低緯度地區(qū)適應(yīng)；在人工選擇下，GmLDL2H2等位基因促進(jìn)大豆在高緯度地區(qū)適應(yīng)。GmLDL2通過(guò)改變GmFER基因位點(diǎn)上的H3K4甲基化狀態(tài)抑制GmFER表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控開(kāi)花時(shí)間。
研究方法
（1）早花大豆突變體ef1篩選與并因果基因鑒定
通過(guò)60Co γ射線(xiàn)誘變HX3，篩選獲得穩(wěn)定遺傳的早花突變體ef1，ef1在短日照（SD）和長(zhǎng)日照（LD）條件下均表現(xiàn)出顯著早花。通過(guò)圖位克隆技術(shù)，將ef1基因定位到第6染色體的一個(gè)0.5 Mb區(qū)域，并最終鑒定出GmLDL2基因。GmLDL2基因編碼一個(gè)與擬南芥組蛋白去甲基化酶LDL2同源的蛋白，ef1突變體中GmLDL2基因的第一外顯子存在1 bp缺失，導(dǎo)致移碼突變和提前終止，產(chǎn)生截短蛋白（圖1h）。這一結(jié)果為后續(xù)研究提供了基礎(chǔ)。
b. 短日照（SD,11h光照/13h黑暗）和長(zhǎng)日照（LD,15h光照/9h黑暗）條件下，HX3和ef1開(kāi)花時(shí)間。
c. 在廣州夏季的田間條件下，HX3和ef1的成熟時(shí)間。
d. 在田間條件下，全年播種日期與HX3和ef1開(kāi)花時(shí)間的關(guān)系。
e. 在田間條件下，HX3與ef1雜交的F2代開(kāi)花時(shí)間頻率分布。
f. 沿染色體的SNP指數(shù)分布。
g. 廣東農(nóng)家品種LNHM與ef1的F2群體進(jìn)行ef1的精細(xì)定位。
h. AtLDL2和GmLDL2的比較。粉色和灰色方塊分別代表SWRIM和胺氧化酶結(jié)構(gòu)域。
（2）驗(yàn)證GmLDL2在調(diào)控大豆開(kāi)花中的功能
為了驗(yàn)證GmLDL2的功能，研究者將GmLDL2基因的編碼序列（CDS）在ef1突變體背景下過(guò)表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植株開(kāi)花時(shí)間延遲，證實(shí)了GmLDL2是ef1突變體早期開(kāi)花的因果基因。此外，利用CRISPR/Cas9技術(shù)在HX3背景中敲除GmLDL2基因，生成了兩個(gè)Gmldl2突變體Gmldl2-2和Gmldl2-3，它們均表現(xiàn)出早花表型，進(jìn)一步驗(yàn)證GmLDL2的功能。這些結(jié)果表明GmLDL2在大豆開(kāi)花調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。
b. 在短日照和長(zhǎng)日照條件下，HX3、ef1和兩個(gè)GmLDL2過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因系的開(kāi)花時(shí)間。
c. 敲除GmLDL2的CRISPR/Cas9的sgRNA設(shè)計(jì)。
d. HX3和Gmldl2突變體中GmLDL2的預(yù)測(cè)氨基酸序列。
e. 在短日照條件下，HX3、ef1、Gmldl2-2和Gmldl2-3的植株和花朵的表型。與HX3相比，ef1、Gmldl2-2和Gmldl2-3開(kāi)花更早。
f. 在短日照和長(zhǎng)日照條件下，所有受檢品種的開(kāi)花時(shí)間。
g-h. 在短日照條件下，HX3、ef1、Gmldl2-2和Gmldl2-3在ZT4時(shí)GmFT2a和GmFT5a的表達(dá)水平。
（3）GmLDL2的組蛋白去甲基化酶活性測(cè)定
通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，研究者發(fā)現(xiàn)GmLDL2對(duì)H3K4me1和H3K4me2具有去甲基化活性，但對(duì)H3K4me3、H3K9me2、H3K27me1或H3K36me3沒(méi)有活性。在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)GmLDL2，并檢測(cè)其對(duì)組蛋白修飾的影響，發(fā)現(xiàn)GmLDL2顯著降低了H3K4me1和H3K4me2的信號(hào)水平。這些結(jié)果表明GmLDL2是一個(gè)特異性H3K4去甲基化酶，可能通過(guò)調(diào)控H3K4me1和H3K4me2水平來(lái)作用基因表達(dá)。
b. 使用ImageJ對(duì)（a）進(jìn)行定量分析。
c. GmLDL2-GFP在本氏煙（N.benthamiana）葉片中顯示出H3K4me1/2去甲基化活性。
d. 對(duì)（c）中的熒光信號(hào)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
（4）GmLDL2介導(dǎo)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組分析
對(duì)HX3和ef1的葉片進(jìn)行RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)與HX3相比，ef1中有440個(gè)基因上調(diào)和372個(gè)基因下調(diào)。GO富集分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因主要參與激酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，而下調(diào)基因主要富集在分子功能、結(jié)合、細(xì)胞外區(qū)域和細(xì)胞壁功能。KEGG分析顯示，上調(diào)基因與脂肪酸代謝、亞油酸代謝、單萜生物合成等通路相關(guān)，而下調(diào)基因主要富集在異喹啉生物堿代謝、檸檬烯和蒎烯降解等通路。這些結(jié)果表明GmLDL2可能通過(guò)調(diào)控這些基因的表達(dá)來(lái)影響大豆的開(kāi)花時(shí)間和適應(yīng)性。
b-c. 分別在ef1中上調(diào)的440個(gè)基因或下調(diào)的372個(gè)基因中富集的GO分析。外圈表示GO分類(lèi)，中圈表示大豆基因組背景中每個(gè)GO基因數(shù)量，內(nèi)圈表示差異表達(dá)基因的數(shù)量。
d. HX3和ef1中已知開(kāi)花調(diào)控基因的表達(dá)譜熱圖。
（5）GmLDL2結(jié)合位點(diǎn)的ChIP-seq分析
利用ChIP-seq技術(shù)，研究者鑒定出GmLDL2在全基因組范圍內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)抗GmLDL2抗體進(jìn)行ChIP-seq分析，發(fā)現(xiàn)GmLDL2結(jié)合位點(diǎn)主要分布在基因區(qū)域，尤其是基因下游區(qū)域。分析H3K4me1、H3K4me2和H3K4me3的分布模式，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诨騾^(qū)域的分布模式不同，H3K4me1和H3K4me2在基因下游區(qū)域的水平較高。這些結(jié)果表明GmLDL2可能通過(guò)結(jié)合特定基因區(qū)域并調(diào)控H3K4me1和H3K4me2的水平來(lái)影響基因表達(dá)。ChIP-seq分析還揭示了GmLDL2結(jié)合位點(diǎn)與基因表達(dá)水平之間的相關(guān)性，為后續(xù)研究提供了重要的線(xiàn)索。
b. 在HX3和ef1中，根據(jù)表達(dá)水平分為三組基因的H3K4me1、H3K4me2和H3K4me3的reads分布。將genebody區(qū)域劃分為等分區(qū)間，以10 bp滑動(dòng)窗口計(jì)算TSS上游1.5 kb和TES下游reads分布。Metaplots表示每組基因的歸一化reads分布平均值。熱圖顯示所有基因的reads分布。每組基因按基因表達(dá)水平（FPKM）從高到低排序。TSS表示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，TES表示轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。
c. 在ef1中上調(diào)基因、ef1中H3K4me1/2高甲基化基因以及GmLDL2結(jié)合基因間的重疊維恩圖。
d. HX3和ef1中GmFER位點(diǎn)的RNA-seq、抗GmLDL2、抗H3K4me1和抗H3K4me2 ChIP-seq數(shù)據(jù)的基因組軌跡。
e. GmFER表達(dá)水平的qRT-PCR分析。
f-g. GmFER位點(diǎn)的H3K4me1和H3K4me2甲基化狀態(tài)的ChIP-qPCR分析。
h. GmLDL2與GmFER位點(diǎn)結(jié)合的ChIP-qPCR分析。
（6）鑒定GmLDL2的特定靶基因
結(jié)合RNA-seq和ChIP-seq數(shù)據(jù)，研究者鑒定出GmLDL2的特定靶基因GmFER。GmFER基因與擬南芥FERONIA基因同源，其在ef1中的表達(dá)顯著上調(diào)，并且GmLDL2結(jié)合位點(diǎn)的H3K4me1和H3K4me2水平增加。通過(guò)RT-qPCR和ChIP-qPCR驗(yàn)證GmFER在ef1中表達(dá)上調(diào)，且GmLDL2結(jié)合位點(diǎn)的H3K4me1和H3K4me2水平增加。這些結(jié)果表明GmLDL2通過(guò)直接結(jié)合GmFER基因并調(diào)控其H3K4me1和H3K4me2水平來(lái)抑制其表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控大豆的開(kāi)花時(shí)間。
（7）GmLDL2通過(guò)GmFER依賴(lài)性方式負(fù)向調(diào)控大豆開(kāi)花
在擬南芥中過(guò)表達(dá)GmFER，發(fā)現(xiàn)開(kāi)花時(shí)間提前，表明GmFER在開(kāi)花調(diào)控中發(fā)揮促進(jìn)作用。在大豆中過(guò)表達(dá)GmFER，同樣發(fā)現(xiàn)開(kāi)花時(shí)間提前。通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)在Gmldl2突變體背景下敲除GmFER，生成Gmldl2/fer雙突變體，發(fā)現(xiàn)雙突變體開(kāi)花時(shí)間延遲。這些結(jié)果表明GmLDL2通過(guò)GmFER依賴(lài)性方式負(fù)向調(diào)控大豆開(kāi)花，揭示了GmLDL2-GmFER模塊在大豆開(kāi)花時(shí)間調(diào)控中的重要作用。
b. HX3和GmFER-OE轉(zhuǎn)基因植株中GmFER的表達(dá)水平。。
c. 使用抗Flag抗體的western blot驗(yàn)證GmFER-OE轉(zhuǎn)基因植株中GmFER的表達(dá)。
d. 在短日照和長(zhǎng)日照條件下，HX3和GmFER-OE植株的開(kāi)花時(shí)間。
e. 在Gmldl2突變體背景下，敲除GmFER的CRISPR/Cas9的sgRNA設(shè)計(jì)。
f. HX3和Gmldl2/fer雙突變體中GmLDL2和GmFER的預(yù)測(cè)氨基酸序列。
g. 在長(zhǎng)日照條件下，HX3、ef1、Gmldl2-2/fer和Gmldl2-3/fer的植株和花朵表型。與ef1相比，所有Gmldl2/fer雙突變體開(kāi)花更晚。
h. 在短日照和長(zhǎng)日照條件下，所有受檢品種的開(kāi)花時(shí)間。
（8）不同的GmLDL2等位基因促進(jìn)大豆區(qū)域適應(yīng)性
通過(guò)對(duì)2898份大豆品種的全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)GmLDL2基因存在兩種主要單倍型GmLDL2H1和GmLDL2H2。GmLDL2H1在低緯度地區(qū)的大豆品種中頻率較高，而GmLDL2H2在高緯度地區(qū)的大豆品種中頻率較高。這兩種單倍型的GmLDL2在H3K4me2的去甲基化活性上存在顯著差異，GmLDL2H1的活性高于GmLDL2H2（圖7d-g）。這些結(jié)果表明GmLDL2的不同等位基因可能通過(guò)調(diào)控GmFER表達(dá)水平來(lái)影響大豆的開(kāi)花時(shí)間和區(qū)域適應(yīng)性。
b. 在三個(gè)種質(zhì)群體中，GmLDL2單倍型比例。
c. 在中國(guó)，攜帶GmLDL2H1和GmLDL2H2栽培品種的地理分布。NE表示中國(guó)東北地區(qū)；NR表示中國(guó)北部地區(qū)；HR表示中國(guó)黃淮地區(qū)；SR表示中國(guó)南方地區(qū)。
d. 在本氏煙葉片中對(duì)GmLDL2H1和GmLDL2H2的去甲基化活性進(jìn)行測(cè)定。
e. 對(duì)(d)中的熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)分析。
f. H3K4me1/2去甲基化活性測(cè)定，使用特異性甲基化抗體確定組蛋白的甲基化狀態(tài)。
g. 使用ImageJ對(duì)(f)進(jìn)行的定量分析。
h–j. 在廣州和三亞的自然短日照條件下，攜帶GmLDL2H1（n=18個(gè)品種）和GmLDL2H2（n=46個(gè)品種）的大豆品種的開(kāi)花時(shí)間、株高和粒重統(tǒng)計(jì)情況。
結(jié)論和啟示
本研究揭示了GmLDL2在大豆開(kāi)花進(jìn)程調(diào)控中的重要作用，特別是其通過(guò)直接調(diào)控GmFER基因表達(dá)來(lái)影響大豆的開(kāi)花時(shí)間和區(qū)域適應(yīng)性。GmLDL2作為一個(gè)特異性H3K4去甲基化酶，通過(guò)結(jié)合GmFER基因并調(diào)控其H3K4me1和H3K4me2水平來(lái)抑制其表達(dá)。這一調(diào)控機(jī)制獨(dú)立于經(jīng)典的EC-E1通路，為理解大豆開(kāi)花進(jìn)程調(diào)控提供了新的視角。此外，GmLDL2的不同等位基因在大豆適應(yīng)低緯度和高緯度地區(qū)中分別發(fā)揮作用，表明GmLDL2在大豆馴化和適應(yīng)性進(jìn)化中具有重要意義。
ChIP-seq和RNA-seq技術(shù)在本研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，不僅幫助鑒定GmLDL2的結(jié)合位點(diǎn)和靶基因，還揭示了GmLDL2調(diào)控基因表達(dá)的分子機(jī)制。這些技術(shù)的應(yīng)用為未來(lái)類(lèi)似研究提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)和參考。
參考文獻(xiàn)：
Liu M, Fang Y, Jiang J, Chen H, Yang B, Xu X, Liu G, Ling C, Dong Z, Yang C, Wang Y. Natural variation in histone demethylase GmLDL2 confers flowering time divergence for geographical expansion in soybean. Nat Commun. 2025 Jul 1;16(1):5687. doi: 10.1038/s41467-025-61328-6.
標(biāo)題：Natural variation in histone demethylase GmLDL2 confers flowering time divergence for geographical expansion in soybean（組蛋白去甲基化酶GmLDL2自然變異調(diào)控大豆開(kāi)花時(shí)間分化和地理適應(yīng)性）
發(fā)表時(shí)間：2025年7月1日
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：IF15.7/Q1
技術(shù)平臺(tái)：ChIP-seq、RNA-seq等（易基因金牌技術(shù)）
作者單位：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
DOI：10.1038/s41467-025-61328-6
在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間開(kāi)花是決定大豆區(qū)域適應(yīng)性和產(chǎn)量的關(guān)鍵性狀之一。此前，盡管已在大豆中鑒定出幾個(gè)調(diào)控開(kāi)花時(shí)間的關(guān)鍵基因，但相關(guān)表觀遺傳調(diào)控因子尚不完全清楚。本研究鑒定出一個(gè)早花突變體（ef1），并克隆其“因果”基因GmLDL2。其中，酶活性實(shí)驗(yàn)表明，GmLDL2對(duì)H3K4me1和H3K4me2（H3K4me1/2）具有去甲基化活性。ChIP-seq和RNA-seq整合分析表明，GmLDL2直接抑制大豆FERONIA同源基因GmFER表達(dá)。遺傳分析揭示GmLDL2以GmFER依賴(lài)性方式調(diào)控大豆開(kāi)花。GmLDL2兩種單倍型GmLDL2H1和GmLDL2H2表現(xiàn)出差異去甲基化活性，可能分別促進(jìn)大豆對(duì)低緯度和高緯度地區(qū)適應(yīng)性。總之，本研究發(fā)現(xiàn)揭示了GmLDL2-GmFER模塊在調(diào)控大豆開(kāi)花中的作用，并為改良大豆的區(qū)域適應(yīng)性補(bǔ)充了關(guān)鍵信息。
圖形摘要：GmLDL2在調(diào)控大豆開(kāi)花時(shí)間和提高低緯度適應(yīng)性中的作用模型
研究方法
- 早花突變體ef1篩選和基因鑒定：誘變大豆品種Huaxia3（HX3），篩選出早期開(kāi)花突變體ef1�？寺¤b定出GmLDL2基因，該基因編碼擬南芥組蛋白去甲基化酶LDL2同源蛋白。
- GmLDL2功能驗(yàn)證：在ef1突變體背景下過(guò)表達(dá)GmLDL2基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株開(kāi)花時(shí)間延遲，證實(shí)GmLDL2是ef1突變體早花的因果基因。敲除GmLDL2基因進(jìn)一步驗(yàn)證GmLDL2功能。
- GmLDL2組蛋白去甲基化酶活性測(cè)定：體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GmLDL2對(duì)H3K4me1/2具有去甲基化活性。在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)GmLDL2，并檢測(cè)其對(duì)組蛋白修飾的作用，進(jìn)一步驗(yàn)證其去甲基化酶活性。
- 轉(zhuǎn)錄組分析（RNA-seq）：對(duì)HX3（對(duì)照組）和ef1（突變組）葉片進(jìn)行RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)ef1中有440個(gè)基因上調(diào)和372個(gè)基因下調(diào)。GO和KEGG分析揭示這些差異表達(dá)基因的功能富集。
- ChIP-seq：利用ChIP-seq技術(shù)鑒定GmLDL2在全基因組范圍內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)，并分析其對(duì)組蛋白修飾的作用。發(fā)現(xiàn)GmLDL2結(jié)合并調(diào)控的基因GmFER，該基因與擬南芥FERONIA基因同源。
- GmLDL2特定靶基因鑒定：結(jié)合RNA-seq和ChIP-seq數(shù)據(jù)，鑒定GmLDL2的特定靶基因GmFER。RT-qPCR和ChIP-qPCR驗(yàn)證GmFER在ef1中表達(dá)上調(diào)，且GmLDL2結(jié)合位點(diǎn)的H3K4me1/2水平增加。
- GmLDL2在開(kāi)花時(shí)間調(diào)控中的功能驗(yàn)證：在擬南芥和大豆中過(guò)表達(dá)GmFER，發(fā)現(xiàn)開(kāi)花時(shí)間提前。在Gmldl2突變體背景下敲除GmFER，生成Gmldl2/fer雙突變體，發(fā)現(xiàn)雙突變體開(kāi)花時(shí)間延遲，進(jìn)一步驗(yàn)證GmLDL2通過(guò)GmFER調(diào)控開(kāi)花時(shí)間。
- GmLDL2等位基因的地理適應(yīng)性分析：通過(guò)對(duì)2898份大豆品種的全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)GmLDL2基因存在兩種主要單倍型GmLDL2H1和GmLDL2H2，其在大豆適應(yīng)低緯度和高緯度地區(qū)中分別發(fā)揮作用。
（1）早花大豆突變體ef1篩選與并因果基因鑒定
通過(guò)60Co γ射線(xiàn)誘變HX3，篩選獲得穩(wěn)定遺傳的早花突變體ef1，ef1在短日照（SD）和長(zhǎng)日照（LD）條件下均表現(xiàn)出顯著早花。通過(guò)圖位克隆技術(shù)，將ef1基因定位到第6染色體的一個(gè)0.5 Mb區(qū)域，并最終鑒定出GmLDL2基因。GmLDL2基因編碼一個(gè)與擬南芥組蛋白去甲基化酶LDL2同源的蛋白，ef1突變體中GmLDL2基因的第一外顯子存在1 bp缺失，導(dǎo)致移碼突變和提前終止，產(chǎn)生截短蛋白（圖1h）。這一結(jié)果為后續(xù)研究提供了基礎(chǔ)。
圖1：通過(guò)圖位克隆鑒定ef1基因。
a. 短日照條件下，HX3和ef1植株及花朵表型。ef1比HX3更早花。b. 短日照（SD,11h光照/13h黑暗）和長(zhǎng)日照（LD,15h光照/9h黑暗）條件下，HX3和ef1開(kāi)花時(shí)間。
c. 在廣州夏季的田間條件下，HX3和ef1的成熟時(shí)間。
d. 在田間條件下，全年播種日期與HX3和ef1開(kāi)花時(shí)間的關(guān)系。
e. 在田間條件下，HX3與ef1雜交的F2代開(kāi)花時(shí)間頻率分布。
f. 沿染色體的SNP指數(shù)分布。
g. 廣東農(nóng)家品種LNHM與ef1的F2群體進(jìn)行ef1的精細(xì)定位。
h. AtLDL2和GmLDL2的比較。粉色和灰色方塊分別代表SWRIM和胺氧化酶結(jié)構(gòu)域。
（2）驗(yàn)證GmLDL2在調(diào)控大豆開(kāi)花中的功能
為了驗(yàn)證GmLDL2的功能，研究者將GmLDL2基因的編碼序列（CDS）在ef1突變體背景下過(guò)表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植株開(kāi)花時(shí)間延遲，證實(shí)了GmLDL2是ef1突變體早期開(kāi)花的因果基因。此外，利用CRISPR/Cas9技術(shù)在HX3背景中敲除GmLDL2基因，生成了兩個(gè)Gmldl2突變體Gmldl2-2和Gmldl2-3，它們均表現(xiàn)出早花表型，進(jìn)一步驗(yàn)證GmLDL2的功能。這些結(jié)果表明GmLDL2在大豆開(kāi)花調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。
圖2：GmLDL2延遲大豆的開(kāi)花時(shí)間。
a. 在短日照條件下，HX3、ef1和兩個(gè)GmLDL2過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因系的植株和花朵的表型。與ef1相比，兩個(gè)GmLDL2互補(bǔ)系開(kāi)花更晚。b. 在短日照和長(zhǎng)日照條件下，HX3、ef1和兩個(gè)GmLDL2過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因系的開(kāi)花時(shí)間。
c. 敲除GmLDL2的CRISPR/Cas9的sgRNA設(shè)計(jì)。
d. HX3和Gmldl2突變體中GmLDL2的預(yù)測(cè)氨基酸序列。
e. 在短日照條件下，HX3、ef1、Gmldl2-2和Gmldl2-3的植株和花朵的表型。與HX3相比，ef1、Gmldl2-2和Gmldl2-3開(kāi)花更早。
f. 在短日照和長(zhǎng)日照條件下，所有受檢品種的開(kāi)花時(shí)間。
g-h. 在短日照條件下，HX3、ef1、Gmldl2-2和Gmldl2-3在ZT4時(shí)GmFT2a和GmFT5a的表達(dá)水平。
（3）GmLDL2的組蛋白去甲基化酶活性測(cè)定
通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，研究者發(fā)現(xiàn)GmLDL2對(duì)H3K4me1和H3K4me2具有去甲基化活性，但對(duì)H3K4me3、H3K9me2、H3K27me1或H3K36me3沒(méi)有活性。在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)GmLDL2，并檢測(cè)其對(duì)組蛋白修飾的影響，發(fā)現(xiàn)GmLDL2顯著降低了H3K4me1和H3K4me2的信號(hào)水平。這些結(jié)果表明GmLDL2是一個(gè)特異性H3K4去甲基化酶，可能通過(guò)調(diào)控H3K4me1和H3K4me2水平來(lái)作用基因表達(dá)。
圖3：GmLDL2是一種H3K4去甲基化酶。
a. 從大腸桿菌中純化的重組His-GmLDL2與小牛胸腺組蛋白一起孵育，用于H3K4me1/2去甲基化活性測(cè)定，使用特異性甲基化抗體確定組蛋白的甲基化狀態(tài)。b. 使用ImageJ對(duì)（a）進(jìn)行定量分析。
c. GmLDL2-GFP在本氏煙（N.benthamiana）葉片中顯示出H3K4me1/2去甲基化活性。
d. 對(duì)（c）中的熒光信號(hào)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
（4）GmLDL2介導(dǎo)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組分析
對(duì)HX3和ef1的葉片進(jìn)行RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)與HX3相比，ef1中有440個(gè)基因上調(diào)和372個(gè)基因下調(diào)。GO富集分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因主要參與激酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，而下調(diào)基因主要富集在分子功能、結(jié)合、細(xì)胞外區(qū)域和細(xì)胞壁功能。KEGG分析顯示，上調(diào)基因與脂肪酸代謝、亞油酸代謝、單萜生物合成等通路相關(guān)，而下調(diào)基因主要富集在異喹啉生物堿代謝、檸檬烯和蒎烯降解等通路。這些結(jié)果表明GmLDL2可能通過(guò)調(diào)控這些基因的表達(dá)來(lái)影響大豆的開(kāi)花時(shí)間和適應(yīng)性。
圖4：HX3和ef1的轉(zhuǎn)錄組分析。
a. HX3和ef1中差異表達(dá)基因的火山圖。ef1中上調(diào)和下調(diào)的基因分別用紅色和藍(lán)色突出顯示。b-c. 分別在ef1中上調(diào)的440個(gè)基因或下調(diào)的372個(gè)基因中富集的GO分析。外圈表示GO分類(lèi)，中圈表示大豆基因組背景中每個(gè)GO基因數(shù)量，內(nèi)圈表示差異表達(dá)基因的數(shù)量。
d. HX3和ef1中已知開(kāi)花調(diào)控基因的表達(dá)譜熱圖。
（5）GmLDL2結(jié)合位點(diǎn)的ChIP-seq分析
利用ChIP-seq技術(shù)，研究者鑒定出GmLDL2在全基因組范圍內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)抗GmLDL2抗體進(jìn)行ChIP-seq分析，發(fā)現(xiàn)GmLDL2結(jié)合位點(diǎn)主要分布在基因區(qū)域，尤其是基因下游區(qū)域。分析H3K4me1、H3K4me2和H3K4me3的分布模式，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诨騾^(qū)域的分布模式不同，H3K4me1和H3K4me2在基因下游區(qū)域的水平較高。這些結(jié)果表明GmLDL2可能通過(guò)結(jié)合特定基因區(qū)域并調(diào)控H3K4me1和H3K4me2的水平來(lái)影響基因表達(dá)。ChIP-seq分析還揭示了GmLDL2結(jié)合位點(diǎn)與基因表達(dá)水平之間的相關(guān)性，為后續(xù)研究提供了重要的線(xiàn)索。
圖5：GmLDL2通過(guò)H3K4甲基化調(diào)控靶基因GmFER轉(zhuǎn)錄。
a. 在genebody區(qū)域以及±1.5 kb處的H3K4me1、H3K4me2和H3K4me3信號(hào)的歸一化reads分布，線(xiàn)條顯示HX3和ef1中所有基因的平均值。b. 在HX3和ef1中，根據(jù)表達(dá)水平分為三組基因的H3K4me1、H3K4me2和H3K4me3的reads分布。將genebody區(qū)域劃分為等分區(qū)間，以10 bp滑動(dòng)窗口計(jì)算TSS上游1.5 kb和TES下游reads分布。Metaplots表示每組基因的歸一化reads分布平均值。熱圖顯示所有基因的reads分布。每組基因按基因表達(dá)水平（FPKM）從高到低排序。TSS表示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，TES表示轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。
c. 在ef1中上調(diào)基因、ef1中H3K4me1/2高甲基化基因以及GmLDL2結(jié)合基因間的重疊維恩圖。
d. HX3和ef1中GmFER位點(diǎn)的RNA-seq、抗GmLDL2、抗H3K4me1和抗H3K4me2 ChIP-seq數(shù)據(jù)的基因組軌跡。
e. GmFER表達(dá)水平的qRT-PCR分析。
f-g. GmFER位點(diǎn)的H3K4me1和H3K4me2甲基化狀態(tài)的ChIP-qPCR分析。
h. GmLDL2與GmFER位點(diǎn)結(jié)合的ChIP-qPCR分析。
（6）鑒定GmLDL2的特定靶基因
結(jié)合RNA-seq和ChIP-seq數(shù)據(jù)，研究者鑒定出GmLDL2的特定靶基因GmFER。GmFER基因與擬南芥FERONIA基因同源，其在ef1中的表達(dá)顯著上調(diào)，并且GmLDL2結(jié)合位點(diǎn)的H3K4me1和H3K4me2水平增加。通過(guò)RT-qPCR和ChIP-qPCR驗(yàn)證GmFER在ef1中表達(dá)上調(diào)，且GmLDL2結(jié)合位點(diǎn)的H3K4me1和H3K4me2水平增加。這些結(jié)果表明GmLDL2通過(guò)直接結(jié)合GmFER基因并調(diào)控其H3K4me1和H3K4me2水平來(lái)抑制其表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控大豆的開(kāi)花時(shí)間。
（7）GmLDL2通過(guò)GmFER依賴(lài)性方式負(fù)向調(diào)控大豆開(kāi)花
在擬南芥中過(guò)表達(dá)GmFER，發(fā)現(xiàn)開(kāi)花時(shí)間提前，表明GmFER在開(kāi)花調(diào)控中發(fā)揮促進(jìn)作用。在大豆中過(guò)表達(dá)GmFER，同樣發(fā)現(xiàn)開(kāi)花時(shí)間提前。通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)在Gmldl2突變體背景下敲除GmFER，生成Gmldl2/fer雙突變體，發(fā)現(xiàn)雙突變體開(kāi)花時(shí)間延遲。這些結(jié)果表明GmLDL2通過(guò)GmFER依賴(lài)性方式負(fù)向調(diào)控大豆開(kāi)花，揭示了GmLDL2-GmFER模塊在大豆開(kāi)花時(shí)間調(diào)控中的重要作用。
圖6：GmLDL2以GmFER依賴(lài)性方式調(diào)控開(kāi)花。
a. 在短日照條件下，HX3和兩個(gè)GmFER過(guò)表達(dá)（GmFER-OE）轉(zhuǎn)基因系的植株和花朵表型。與HX3相比，兩個(gè)獨(dú)立的GmFER-OE轉(zhuǎn)基因植株開(kāi)花更早。b. HX3和GmFER-OE轉(zhuǎn)基因植株中GmFER的表達(dá)水平。。
c. 使用抗Flag抗體的western blot驗(yàn)證GmFER-OE轉(zhuǎn)基因植株中GmFER的表達(dá)。
d. 在短日照和長(zhǎng)日照條件下，HX3和GmFER-OE植株的開(kāi)花時(shí)間。
e. 在Gmldl2突變體背景下，敲除GmFER的CRISPR/Cas9的sgRNA設(shè)計(jì)。
f. HX3和Gmldl2/fer雙突變體中GmLDL2和GmFER的預(yù)測(cè)氨基酸序列。
g. 在長(zhǎng)日照條件下，HX3、ef1、Gmldl2-2/fer和Gmldl2-3/fer的植株和花朵表型。與ef1相比，所有Gmldl2/fer雙突變體開(kāi)花更晚。
h. 在短日照和長(zhǎng)日照條件下，所有受檢品種的開(kāi)花時(shí)間。
（8）不同的GmLDL2等位基因促進(jìn)大豆區(qū)域適應(yīng)性
通過(guò)對(duì)2898份大豆品種的全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)GmLDL2基因存在兩種主要單倍型GmLDL2H1和GmLDL2H2。GmLDL2H1在低緯度地區(qū)的大豆品種中頻率較高，而GmLDL2H2在高緯度地區(qū)的大豆品種中頻率較高。這兩種單倍型的GmLDL2在H3K4me2的去甲基化活性上存在顯著差異，GmLDL2H1的活性高于GmLDL2H2（圖7d-g）。這些結(jié)果表明GmLDL2的不同等位基因可能通過(guò)調(diào)控GmFER表達(dá)水平來(lái)影響大豆的開(kāi)花時(shí)間和區(qū)域適應(yīng)性。
圖7：GmLDL2對(duì)大豆緯度適應(yīng)性的貢獻(xiàn)
a. 在野生大豆、地方品種和改良品種中，GmLDL2的2Mb基因組區(qū)域內(nèi)，F(xiàn)st指示的核苷酸變異情況。b. 在三個(gè)種質(zhì)群體中，GmLDL2單倍型比例。
c. 在中國(guó)，攜帶GmLDL2H1和GmLDL2H2栽培品種的地理分布。NE表示中國(guó)東北地區(qū)；NR表示中國(guó)北部地區(qū)；HR表示中國(guó)黃淮地區(qū)；SR表示中國(guó)南方地區(qū)。
d. 在本氏煙葉片中對(duì)GmLDL2H1和GmLDL2H2的去甲基化活性進(jìn)行測(cè)定。
e. 對(duì)(d)中的熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)分析。
f. H3K4me1/2去甲基化活性測(cè)定，使用特異性甲基化抗體確定組蛋白的甲基化狀態(tài)。
g. 使用ImageJ對(duì)(f)進(jìn)行的定量分析。
h–j. 在廣州和三亞的自然短日照條件下，攜帶GmLDL2H1（n=18個(gè)品種）和GmLDL2H2（n=46個(gè)品種）的大豆品種的開(kāi)花時(shí)間、株高和粒重統(tǒng)計(jì)情況。
結(jié)論和啟示
本研究揭示了GmLDL2在大豆開(kāi)花進(jìn)程調(diào)控中的重要作用，特別是其通過(guò)直接調(diào)控GmFER基因表達(dá)來(lái)影響大豆的開(kāi)花時(shí)間和區(qū)域適應(yīng)性。GmLDL2作為一個(gè)特異性H3K4去甲基化酶，通過(guò)結(jié)合GmFER基因并調(diào)控其H3K4me1和H3K4me2水平來(lái)抑制其表達(dá)。這一調(diào)控機(jī)制獨(dú)立于經(jīng)典的EC-E1通路，為理解大豆開(kāi)花進(jìn)程調(diào)控提供了新的視角。此外，GmLDL2的不同等位基因在大豆適應(yīng)低緯度和高緯度地區(qū)中分別發(fā)揮作用，表明GmLDL2在大豆馴化和適應(yīng)性進(jìn)化中具有重要意義。
ChIP-seq和RNA-seq技術(shù)在本研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，不僅幫助鑒定GmLDL2的結(jié)合位點(diǎn)和靶基因，還揭示了GmLDL2調(diào)控基因表達(dá)的分子機(jī)制。這些技術(shù)的應(yīng)用為未來(lái)類(lèi)似研究提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)和參考。
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