共聚焦顯微鏡鈣成像技術：基于光誘導的細胞信號調控工具
本研究由Yi-Tsang Lee、Lei Guo、Tien-Hung Lan、Tatsuki Nonomura、Gan Liu、Guolin Ma、Rui Wang、Yun Huang和Yubin Zhou共同完成，論文題為"Engineering of photo-inducible binary interaction tools for biomedical applications"，于2025年7月在《Nature Communications》期刊上發(fā)表在線出版。
技術原理
01主流光控方法及其局限
當前主流光控系統(tǒng)主要基于光敏二聚化模塊，包括藍光響應的CRY2-CIB1、LOV2-Zdk1系統(tǒng)，紫外響應的UVR8-COP1系統(tǒng)，以及紅光響應的PhyB-PIF系統(tǒng)。這些系統(tǒng)雖然廣泛應用，但存在明顯局限性：光敏蛋白尺寸較大（通常超過400個氨基酸），容易干擾目標蛋白功能；二聚化動力學較慢；不同系統(tǒng)間存在光譜串擾問題。特別是CRY2和LOV2系統(tǒng)在黑暗狀態(tài)下常有基礎二聚化活性，導致背景信號較高。
02PhoBIT系統(tǒng)的獨特機制
PhoBIT系統(tǒng)創(chuàng)新性地利用大腸桿菌蛋白質降解機制中的ssrA-sspB配對系統(tǒng)。ssrA是一個僅含7個氨基酸的短肽標簽，而sspB是其13kDa的結合蛋白。研究人員通過兩種策略改造這一系統(tǒng)：PhoBIT1作為"光關"開關，將LOV2結構域插入sspB中，使光誘導的構象變化變構調節(jié)ssrA結合口袋，導致光刺激下的解離；PhoBIT2作為"光開"開關，將CRY2與優(yōu)化的sspB突變體（A56F）融合，利用CRY2的光誘導寡聚化增強與突變ssrA（A2C）的結合。
該系統(tǒng)核心優(yōu)勢在于ssrA標簽的極小尺寸（僅7個氨基酸），可插入大多數蛋白質而不影響其功能，同時保持低背景活性和高光誘導動態(tài)范圍。通過深度突變掃描和結合親和力優(yōu)化，研究人員獲得了背景相互作用最低、光誘導響應最強的突變組合。
重要發(fā)現
01光學調控機制的創(chuàng)新
PhoBIT系統(tǒng)的核心光學創(chuàng)新在于其獨特的光控機制。PhoBIT1通過將LOV2結構域插入sspB的環(huán)區(qū)（特別是S5位點），實現了光依賴的變構調節(jié)。在黑暗狀態(tài)下，LOV2保持sspB與ssrA的結合能力；藍光照射后，LOV2的Jα螺旋構象變化導致ssrA結合口袋結構改變，引發(fā)解離。動力學分析顯示其解離半衰期為8.5秒，再結合半衰期為28.1秒，表現出高度可逆性。
PhoBIT2則采用完全不同的光學機制：通過CRY2的光誘導寡聚化增強結合。研究人員對ssrA肽庫進行深度突變掃描，篩選出140種變異體，最終確定A2C突變體與sspB-A56F組合具有最低背景和最高光誘導結合能力（9.9倍增加）。這種"光開"機制利用CRY2在藍光下的快速寡聚化特性，將sspB突變體聚集到ssrA標簽位置，顯著增強結合親和力。
02先進成像技術的應用
研究團隊采用多種光學成像技術驗證PhoBIT系統(tǒng)功能。共聚焦顯微鏡實時監(jiān)測了蛋白質定位和細胞響應，特別是線粒體錨定實驗清晰展示了光控結合/解離過程。生物發(fā)光共振能量轉移（BRET） assay定量評估了分子間相互作用強度，通過測量NanoLuc與Venus間的能量轉移效率，精確量化了不同突變體的結合特性。
鈣成像技術揭示了PhoBIT2調控STIM1-ORAI通道的動力學過程。使用超靈敏基因編碼鈣指示劑NEMO，研究人員監(jiān)測到光誘導鈣內流的快速啟動（半衰期0.4分鐘）和關閉（半衰期2.9分鐘）。此外，熒光漂白后恢復（FRAP）和單粒子追蹤技術分析了蛋白質運動性和聚集狀態(tài)，為機制理解提供了關鍵數據。
03光控精準性的實驗驗證通過一系列精心設計的實驗，研究人員證明了PhoBIT系統(tǒng)的高精度光控能力。在GPCR調控實驗中，利用Tango assay系統(tǒng)監(jiān)測PAR受體激活，發(fā)現光刺激可誘導2.2-5.7倍的報告基因表達增加。在CRISPRi應用中，PhoBIT1實現了60%的光控基因表達抑制釋放。最令人印象深刻的是在壞死性死亡調控中，僅MLKL-NT-ssrA2-mCherry構建體（A2構型）能誘導光依賴性細胞死亡，6分鐘后出現膜破裂，展示了時間精確的細胞命運控制。
挑戰(zhàn)與展望
PhoBIT技術雖然展現出巨大潛力，但其臨床轉化仍面臨多重挑戰(zhàn)。首先，藍光組織穿透性有限，盡管本研究證明了在皮下移植瘤模型中的有效性，但對于深層組織應用仍需開發(fā)紅光或近紅外響應版本。其次，病毒遞送系統(tǒng)的安全性和效率需要進一步優(yōu)化，特別是體內靶向遞送效率。第三，長期表達可能引發(fā)的免疫反應和毒性需要系統(tǒng)評估。此外，光控系統(tǒng)的時空精度雖然在細胞水平令人滿意，但在整體動物水平需要更精確的光傳遞系統(tǒng)。未來研究方向應包括開發(fā)多色正交系統(tǒng)實現多重調控，優(yōu)化光敏蛋白的動力學參數以適應不同應用場景，以及探索非病毒遞送策略提高治療安全性。同時，將PhoBIT技術與現有治療手段（如化療、免疫治療）結合，開發(fā)聯合治療方案也是重要方向。最終，通過進一步理解光控機制的分子細節(jié)和優(yōu)化系統(tǒng)性能，PhoBIT技術有望成為精準醫(yī)療領域的顛覆性工具，為癌癥、神經疾病和免疫 disorders提供全新的治療范式。
論文信息
聲明：本文僅用作學術目的。
Lee YT, Guo L, Lan TH, Nonomura T, Liu G, Ma G, Wang R, Huang Y, Zhou Y. Engineering of photo-inducible binary interaction tools for biomedical applications. Nat Commun. 2025 Jul 28;16(1):6940.
DOI:10.1038/s41467-025-61710-4.
