從準備工作到日常維護，細胞培養(yǎng)的全流程要點指南
在生命科學(xué)研究中，細胞培養(yǎng)是一項基礎(chǔ)且核心的技術(shù) —— 小到分子機制探索，大到藥物篩選、細胞治療研發(fā)，都離不開健康、穩(wěn)定的細胞體系。但對新手而言，細胞污染、生長緩慢、形態(tài)異常等問題常常讓人頭疼；即使是資深研究者，也可能因操作細節(jié)疏忽導(dǎo)致實驗 “翻車”。今天，我們就從細胞培養(yǎng)的核心原理出發(fā)，梳理從準備工作到日常維護的全流程要點，再聊聊常見問題的解決方案，幫你輕松搞定細胞培養(yǎng)！
細胞對環(huán)境極其敏感，溫度、濕度、無菌狀態(tài)等任何微小偏差，都可能影響其生長。因此，實驗前的準備工作必須 “精益求精”。
1. 核心耗材：選對、滅菌是關(guān)鍵
細胞培養(yǎng)的耗材直接接觸細胞，其質(zhì)量和無菌性是基礎(chǔ)中的基礎(chǔ)，常見耗材及注意事項如下：
培養(yǎng)容器：根據(jù)實驗需求選擇培養(yǎng)皿（直徑 6cm/10cm）、培養(yǎng)瓶（T25/T75/T175）或多孔板（6 孔 / 12 孔 / 24 孔 / 96 孔）。優(yōu)先選擇TC 處理（組織培養(yǎng)處理） 的耗材 —— 這類耗材表面經(jīng)過特殊涂層，能促進細胞貼壁生長（懸浮細胞可忽略此要求）。使用前需檢查包裝是否完好，避免因運輸或儲存不當導(dǎo)致污染。
培養(yǎng)基與添加劑：不同細胞系對培養(yǎng)基的需求差異極大，比如 HeLa 細胞常用 DMEM，CHO 細胞偏好 F12，原代細胞則可能需要專用培養(yǎng)基。
關(guān)鍵注意點：
✅ 培養(yǎng)基需添加胎牛血清（FBS） （通常終濃度 10%-20%），提供細胞生長所需的營養(yǎng)因子；
✅ 加入雙抗（青霉素 - 鏈霉素） （終濃度 1%），預(yù)防細菌污染（特殊實驗如細胞治療需無抗培養(yǎng)）；
✅ 部分細胞需額外添加特定因子，如內(nèi)皮細胞需 VEGF，神經(jīng)細胞需 BDNF，需嚴格參照細胞說明書。培養(yǎng)基配制后需 4℃避光儲存，且儲存時間不超過 2 周，避免營養(yǎng)成分降解。
其他耗材：移液管、離心管、槍頭需選擇無菌無酶規(guī)格，避免酶類物質(zhì)破壞細胞膜；酒精棉球、無菌手套、口罩需提前準備，確保操作過程無菌。
2. 儀器檢查：確保設(shè)備處于最佳狀態(tài)
細胞培養(yǎng)依賴的核心儀器需提前調(diào)試，避免實驗中 “掉鏈子”：
CO₂培養(yǎng)箱：溫度需穩(wěn)定在 37℃（誤差 ±0.5℃），CO₂濃度通常為 5%（維持培養(yǎng)基 pH 穩(wěn)定，依賴 NaHCO₃緩沖體系），相對濕度保持在 95% 以上（防止培養(yǎng)基蒸發(fā)）。使用前需用酒精擦拭內(nèi)壁，定期（每 1-2 周）進行紫外消毒，避免霉菌滋生。
超凈工作臺：開啟前需紫外線消毒 30 分鐘，消毒后通風(fēng) 15 分鐘再進行操作（避免紫外線殘留損傷細胞）。操作時需保持臺面整潔，僅放置必要耗材，避免手臂頻繁進出破壞無菌環(huán)境。
離心機：用于細胞傳代或換液時的離心操作，需提前校準轉(zhuǎn)速（通常細胞離心轉(zhuǎn)速為 1000-1500rpm，時間 3-5 分鐘，避免轉(zhuǎn)速過高損傷細胞）。
倒置顯微鏡：用于觀察細胞形態(tài)和生長狀態(tài)，需提前調(diào)整焦距和光源，確保視野清晰。
二、細胞培養(yǎng)中：掌握核心操作，避免 “踩坑”
細胞培養(yǎng)的日常操作主要包括換液和傳代，這兩個步驟直接決定細胞的生長狀態(tài)，需嚴格遵循規(guī)范。
1. 換液：及時補充營養(yǎng)，移除代謝廢物
當培養(yǎng)基顏色從桃紅色（pH 正常）變?yōu)辄S色（pH 下降，代謝廢物積累），或細胞生長至 50%-70% 密度時，需進行換液：
準備工作：將新鮮培養(yǎng)基提前從 4℃取出，復(fù)溫至室溫（約 30 分鐘，避免低溫刺激細胞）；超凈工作臺紫外線消毒后通風(fēng)，戴無菌手套、口罩，用 75% 酒精擦拭雙手和耗材表面。
操作步驟：
打開培養(yǎng)箱，取出培養(yǎng)皿 / 瓶，用酒精棉球擦拭外壁后放入超凈臺；
用移液管輕輕吸出舊培養(yǎng)基（注意避免吸到貼壁細胞，懸浮細胞需先離心收集再換液）；
用無菌 PBS（磷酸鹽緩沖液）清洗細胞 1-2 次（移除殘留的血清和代謝廢物，避免影響新培養(yǎng)基營養(yǎng)）；
加入適量新鮮培養(yǎng)基（培養(yǎng)皿直徑 6cm 加 2-3ml，T25 培養(yǎng)瓶加 5ml，確保覆蓋細胞即可，過多會浪費且影響氣體交換）；
輕輕晃動培養(yǎng)容器，使培養(yǎng)基均勻分布，放回 CO₂培養(yǎng)箱。
2. 傳代：避免細胞過度生長，維持活性
當貼壁細胞生長至 80%-90% 融合度（細胞鋪滿培養(yǎng)皿表面，無明顯間隙），或懸浮細胞密度達到 1×10⁶-5×10⁶ cells/ml 時，需進行傳代，防止細胞因空間不足或營養(yǎng)匱乏進入衰老期：
貼壁細胞傳代（以胰酶消化法為例）；按換液步驟移除舊培養(yǎng)基，用 PBS 清洗細胞 1 次；
加入適量胰酶（T25 培養(yǎng)瓶加 1ml，覆蓋細胞表面即可），放入 37℃培養(yǎng)箱孵育 1-3 分鐘（不同細胞對胰酶敏感性不同，需在顯微鏡下觀察，當細胞間隙增大、開始脫落時立即終止消化）；
加入含血清的新鮮培養(yǎng)基（血清中的胰酶抑制劑可終止消化），用移液管輕輕吹打細胞（動作要輕柔，避免產(chǎn)生過多氣泡損傷細胞），制成單細胞懸液；
取適量細胞懸液（根據(jù)傳代比例，通常 1:2-1:5 傳代，如 T25 瓶細胞傳到 2-5 個新 T25 瓶），加入新鮮培養(yǎng)基，混勻后放回培養(yǎng)箱。
懸浮細胞傳代：
直接將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，1000rpm 離心 5 分鐘；
棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基重懸細胞；
按比例分裝到新的培養(yǎng)容器中，放回培養(yǎng)箱。
三、細胞培養(yǎng)后：觀察與記錄，及時發(fā)現(xiàn)問題
細胞培養(yǎng)不是 “一放了之”，每天的觀察和記錄至關(guān)重要，能幫助我們及時發(fā)現(xiàn)異常，避免實驗損失。
1. 日常觀察要點
每天在倒置顯微鏡下觀察細胞，重點關(guān)注 3 個方面：
細胞形態(tài)：不同細胞有其特征形態(tài)，如 HeLa 細胞呈上皮樣、梭形，CHO 細胞呈圓形或多邊形。若細胞出現(xiàn)皺縮、破碎、貼壁不牢，可能是消化過度、污染或培養(yǎng)基不適導(dǎo)致。
生長密度：記錄細胞融合度（貼壁細胞）或密度（懸浮細胞），判斷是否需要換液或傳代。若細胞生長緩慢，需排查培養(yǎng)基是否過期、血清質(zhì)量是否下降、培養(yǎng)箱溫度 / CO₂濃度是否異常。
是否污染：污染是細胞培養(yǎng)的 “天敵”，常見污染類型及識別方法：
細菌污染：培養(yǎng)基迅速變渾濁（黃色或乳白色），顯微鏡下可見大量小圓點，快速游動或布朗運動；
真菌污染：培養(yǎng)基表面出現(xiàn)白色、綠色或黑色菌絲，或出現(xiàn)圓形孢子，污染初期培養(yǎng)基可能不變渾濁，但細胞會逐漸死亡；
支原體污染：支原體直徑僅 0.2-0.3μm，普通光學(xué)顯微鏡下難以觀察，需通過支原體檢測試劑盒（如 PCR 法、熒光染色法）鑒定，污染后細胞生長緩慢、形態(tài)異常，且會影響實驗結(jié)果（如干擾細胞信號通路、改變基因表達）。
2. 記錄與凍存
實驗記錄：每次操作（換液、傳代、觀察）需詳細記錄，包括日期、細胞名稱、操作步驟、細胞狀態(tài)（形態(tài)、密度）、培養(yǎng)基批次、血清批次等，便于后續(xù)追溯問題。
細胞凍存：當細胞生長狀態(tài)良好時，需及時凍存，避免細胞長期傳代導(dǎo)致遺傳漂變或污染丟失。凍存液通常為 “培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1”（DMSO 為冷凍保護劑，需緩慢加入，避免損傷細胞），凍存過程需遵循 “梯度降溫” 原則：4℃放置 30 分鐘→-20℃放置 1-2 小時→-80℃過夜→轉(zhuǎn)入液氮長期儲存。
四、常見問題 troubleshooting：解決你的 “細胞焦慮”
即使操作規(guī)范，細胞培養(yǎng)中也可能出現(xiàn)各種問題，以下是高頻問題及解決方案：
五、OMNI Life Science 其他細胞研究解決方案
除了 CASY VIVO 細胞計數(shù)儀，OMNI Life Science 還提供多款適配細胞研究的設(shè)備，滿足不同實驗需求：
TIGR 組織研磨解離儀：快速溫和處理組織，無需酶解，可同時處理 4 個樣本，適合組織單細胞懸液制備；
CERO 3D 培養(yǎng)箱生物反應(yīng)器：專為 3D 細胞培養(yǎng)設(shè)計，支持類球體、類器官或組織培養(yǎng)，產(chǎn)量高且操作簡便，助力 3D 細胞研究突破。
寫在最后
細胞培養(yǎng)是一門 “技術(shù) + 耐心” 的學(xué)問，沒有誰能一蹴而就。新手不必因初期的 “失敗” 氣餒，多觀察、多記錄、多總結(jié)，熟悉自己培養(yǎng)的細胞特性，就能逐漸掌握技巧。記�。簾o菌意識貫穿始終，細節(jié)決定成敗 —— 做好每一步，你的細胞自然會 “健康成長”，為后續(xù)實驗打下堅實基礎(chǔ)！
如果在細胞培養(yǎng)中遇到其他棘手問題，歡迎在評論區(qū)留言，我們一起探討解決方案～
關(guān)注我們了解更多內(nèi)容
OLS OMNI Life Science認證的中國授權(quán)經(jīng)銷商：
上海跡亞國際商貿(mào)有限公司
Gaia China Co.,Ltd.
一、細胞培養(yǎng)前：做好這些準備，成功一半
細胞對環(huán)境極其敏感，溫度、濕度、無菌狀態(tài)等任何微小偏差，都可能影響其生長。因此，實驗前的準備工作必須 “精益求精”。
1. 核心耗材：選對、滅菌是關(guān)鍵
細胞培養(yǎng)的耗材直接接觸細胞，其質(zhì)量和無菌性是基礎(chǔ)中的基礎(chǔ)，常見耗材及注意事項如下：
培養(yǎng)容器：根據(jù)實驗需求選擇培養(yǎng)皿（直徑 6cm/10cm）、培養(yǎng)瓶（T25/T75/T175）或多孔板（6 孔 / 12 孔 / 24 孔 / 96 孔）。優(yōu)先選擇TC 處理（組織培養(yǎng)處理） 的耗材 —— 這類耗材表面經(jīng)過特殊涂層，能促進細胞貼壁生長（懸浮細胞可忽略此要求）。使用前需檢查包裝是否完好，避免因運輸或儲存不當導(dǎo)致污染。
培養(yǎng)基與添加劑：不同細胞系對培養(yǎng)基的需求差異極大，比如 HeLa 細胞常用 DMEM，CHO 細胞偏好 F12，原代細胞則可能需要專用培養(yǎng)基。
關(guān)鍵注意點：
✅ 培養(yǎng)基需添加胎牛血清（FBS） （通常終濃度 10%-20%），提供細胞生長所需的營養(yǎng)因子；
✅ 加入雙抗（青霉素 - 鏈霉素） （終濃度 1%），預(yù)防細菌污染（特殊實驗如細胞治療需無抗培養(yǎng)）；
✅ 部分細胞需額外添加特定因子，如內(nèi)皮細胞需 VEGF，神經(jīng)細胞需 BDNF，需嚴格參照細胞說明書。培養(yǎng)基配制后需 4℃避光儲存，且儲存時間不超過 2 周，避免營養(yǎng)成分降解。
其他耗材：移液管、離心管、槍頭需選擇無菌無酶規(guī)格，避免酶類物質(zhì)破壞細胞膜；酒精棉球、無菌手套、口罩需提前準備，確保操作過程無菌。
2. 儀器檢查：確保設(shè)備處于最佳狀態(tài)
細胞培養(yǎng)依賴的核心儀器需提前調(diào)試，避免實驗中 “掉鏈子”：
CO₂培養(yǎng)箱：溫度需穩(wěn)定在 37℃（誤差 ±0.5℃），CO₂濃度通常為 5%（維持培養(yǎng)基 pH 穩(wěn)定，依賴 NaHCO₃緩沖體系），相對濕度保持在 95% 以上（防止培養(yǎng)基蒸發(fā)）。使用前需用酒精擦拭內(nèi)壁，定期（每 1-2 周）進行紫外消毒，避免霉菌滋生。
超凈工作臺：開啟前需紫外線消毒 30 分鐘，消毒后通風(fēng) 15 分鐘再進行操作（避免紫外線殘留損傷細胞）。操作時需保持臺面整潔，僅放置必要耗材，避免手臂頻繁進出破壞無菌環(huán)境。
離心機：用于細胞傳代或換液時的離心操作，需提前校準轉(zhuǎn)速（通常細胞離心轉(zhuǎn)速為 1000-1500rpm，時間 3-5 分鐘，避免轉(zhuǎn)速過高損傷細胞）。
倒置顯微鏡：用于觀察細胞形態(tài)和生長狀態(tài)，需提前調(diào)整焦距和光源，確保視野清晰。
二、細胞培養(yǎng)中：掌握核心操作，避免 “踩坑”
細胞培養(yǎng)的日常操作主要包括換液和傳代，這兩個步驟直接決定細胞的生長狀態(tài)，需嚴格遵循規(guī)范。
1. 換液：及時補充營養(yǎng)，移除代謝廢物
當培養(yǎng)基顏色從桃紅色（pH 正常）變?yōu)辄S色（pH 下降，代謝廢物積累），或細胞生長至 50%-70% 密度時，需進行換液：
準備工作：將新鮮培養(yǎng)基提前從 4℃取出，復(fù)溫至室溫（約 30 分鐘，避免低溫刺激細胞）；超凈工作臺紫外線消毒后通風(fēng)，戴無菌手套、口罩，用 75% 酒精擦拭雙手和耗材表面。
操作步驟：
打開培養(yǎng)箱，取出培養(yǎng)皿 / 瓶，用酒精棉球擦拭外壁后放入超凈臺；
用移液管輕輕吸出舊培養(yǎng)基（注意避免吸到貼壁細胞，懸浮細胞需先離心收集再換液）；
用無菌 PBS（磷酸鹽緩沖液）清洗細胞 1-2 次（移除殘留的血清和代謝廢物，避免影響新培養(yǎng)基營養(yǎng)）；
加入適量新鮮培養(yǎng)基（培養(yǎng)皿直徑 6cm 加 2-3ml，T25 培養(yǎng)瓶加 5ml，確保覆蓋細胞即可，過多會浪費且影響氣體交換）；
輕輕晃動培養(yǎng)容器，使培養(yǎng)基均勻分布，放回 CO₂培養(yǎng)箱。
2. 傳代：避免細胞過度生長，維持活性
當貼壁細胞生長至 80%-90% 融合度（細胞鋪滿培養(yǎng)皿表面，無明顯間隙），或懸浮細胞密度達到 1×10⁶-5×10⁶ cells/ml 時，需進行傳代，防止細胞因空間不足或營養(yǎng)匱乏進入衰老期：
貼壁細胞傳代（以胰酶消化法為例）；按換液步驟移除舊培養(yǎng)基，用 PBS 清洗細胞 1 次；
加入適量胰酶（T25 培養(yǎng)瓶加 1ml，覆蓋細胞表面即可），放入 37℃培養(yǎng)箱孵育 1-3 分鐘（不同細胞對胰酶敏感性不同，需在顯微鏡下觀察，當細胞間隙增大、開始脫落時立即終止消化）；
加入含血清的新鮮培養(yǎng)基（血清中的胰酶抑制劑可終止消化），用移液管輕輕吹打細胞（動作要輕柔，避免產(chǎn)生過多氣泡損傷細胞），制成單細胞懸液；
取適量細胞懸液（根據(jù)傳代比例，通常 1:2-1:5 傳代，如 T25 瓶細胞傳到 2-5 個新 T25 瓶），加入新鮮培養(yǎng)基，混勻后放回培養(yǎng)箱。
懸浮細胞傳代：
直接將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，1000rpm 離心 5 分鐘；
棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基重懸細胞；
按比例分裝到新的培養(yǎng)容器中，放回培養(yǎng)箱。
三、細胞培養(yǎng)后：觀察與記錄，及時發(fā)現(xiàn)問題
細胞培養(yǎng)不是 “一放了之”，每天的觀察和記錄至關(guān)重要，能幫助我們及時發(fā)現(xiàn)異常，避免實驗損失。
1. 日常觀察要點
每天在倒置顯微鏡下觀察細胞，重點關(guān)注 3 個方面：
細胞形態(tài)：不同細胞有其特征形態(tài)，如 HeLa 細胞呈上皮樣、梭形，CHO 細胞呈圓形或多邊形。若細胞出現(xiàn)皺縮、破碎、貼壁不牢，可能是消化過度、污染或培養(yǎng)基不適導(dǎo)致。
生長密度：記錄細胞融合度（貼壁細胞）或密度（懸浮細胞），判斷是否需要換液或傳代。若細胞生長緩慢，需排查培養(yǎng)基是否過期、血清質(zhì)量是否下降、培養(yǎng)箱溫度 / CO₂濃度是否異常。
是否污染：污染是細胞培養(yǎng)的 “天敵”，常見污染類型及識別方法：
細菌污染：培養(yǎng)基迅速變渾濁（黃色或乳白色），顯微鏡下可見大量小圓點，快速游動或布朗運動；
真菌污染：培養(yǎng)基表面出現(xiàn)白色、綠色或黑色菌絲，或出現(xiàn)圓形孢子，污染初期培養(yǎng)基可能不變渾濁，但細胞會逐漸死亡；
支原體污染：支原體直徑僅 0.2-0.3μm，普通光學(xué)顯微鏡下難以觀察，需通過支原體檢測試劑盒（如 PCR 法、熒光染色法）鑒定，污染后細胞生長緩慢、形態(tài)異常，且會影響實驗結(jié)果（如干擾細胞信號通路、改變基因表達）。
2. 記錄與凍存
實驗記錄：每次操作（換液、傳代、觀察）需詳細記錄，包括日期、細胞名稱、操作步驟、細胞狀態(tài)（形態(tài)、密度）、培養(yǎng)基批次、血清批次等，便于后續(xù)追溯問題。
細胞凍存：當細胞生長狀態(tài)良好時，需及時凍存，避免細胞長期傳代導(dǎo)致遺傳漂變或污染丟失。凍存液通常為 “培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1”（DMSO 為冷凍保護劑，需緩慢加入，避免損傷細胞），凍存過程需遵循 “梯度降溫” 原則：4℃放置 30 分鐘→-20℃放置 1-2 小時→-80℃過夜→轉(zhuǎn)入液氮長期儲存。
四、常見問題 troubleshooting：解決你的 “細胞焦慮”
即使操作規(guī)范，細胞培養(yǎng)中也可能出現(xiàn)各種問題，以下是高頻問題及解決方案：
| 常見問題 | 可能原因 | 解決方案 |
| 細胞生長緩慢 | 1. 培養(yǎng)基過期或營養(yǎng)不足；2. 血清質(zhì)量差；3. 培養(yǎng)箱 CO₂/ 溫度異常；4. 細胞傳代次數(shù)過多，衰老 | 1. 更換新鮮培養(yǎng)基；2. 更換優(yōu)質(zhì)血清（建議選擇批次穩(wěn)定的血清，提前試用）；3. 校準培養(yǎng)箱參數(shù)；4. 啟用早期凍存的細胞株 |
| 細胞貼壁不牢 | 1. 耗材非 TC 處理；2. 胰酶消化過度；3. 培養(yǎng)基中缺乏貼壁因子；4. 細胞本身貼壁能力弱 | 1. 更換 TC 處理耗材；2. 縮短胰酶孵育時間，及時用血清終止消化；3. 培養(yǎng)基中添加纖連蛋白、明膠（如原代細胞培養(yǎng)）；4. 降低傳代比例，讓細胞有更多貼壁空間 |
| 培養(yǎng)基渾濁，細胞死亡 | 細菌或真菌污染 | 1. 若污染輕微，可嘗試加入高濃度雙抗（如終濃度 2%），但效果有限；2. 污染嚴重時，需立即丟棄細胞，徹底消毒培養(yǎng)箱和超凈臺（用含氯消毒劑擦拭，紫外消毒），避免交叉污染 |
| 細胞形態(tài)異常，生長停滯 | 1. 支原體污染；2. 培養(yǎng)基 pH 異常；3. 消化不當 | 1. 用支原體檢測試劑盒鑒定，陽性細胞需丟棄，或使用支原體清除試劑（需謹慎，可能影響細胞活性）；2. 檢查培養(yǎng)箱 CO₂濃度，若 pH 過低（培養(yǎng)基變黃），可更換含更高濃度 NaHCO₃的培養(yǎng)基；3. 調(diào)整胰酶濃度和孵育時間，避免過度消化 |
五、OMNI Life Science 其他細胞研究解決方案
除了 CASY VIVO 細胞計數(shù)儀，OMNI Life Science 還提供多款適配細胞研究的設(shè)備，滿足不同實驗需求：
TIGR 組織研磨解離儀：快速溫和處理組織，無需酶解，可同時處理 4 個樣本，適合組織單細胞懸液制備；
CERO 3D 培養(yǎng)箱生物反應(yīng)器：專為 3D 細胞培養(yǎng)設(shè)計，支持類球體、類器官或組織培養(yǎng)，產(chǎn)量高且操作簡便，助力 3D 細胞研究突破。
寫在最后
細胞培養(yǎng)是一門 “技術(shù) + 耐心” 的學(xué)問，沒有誰能一蹴而就。新手不必因初期的 “失敗” 氣餒，多觀察、多記錄、多總結(jié)，熟悉自己培養(yǎng)的細胞特性，就能逐漸掌握技巧。記�。簾o菌意識貫穿始終，細節(jié)決定成敗 —— 做好每一步，你的細胞自然會 “健康成長”，為后續(xù)實驗打下堅實基礎(chǔ)！
如果在細胞培養(yǎng)中遇到其他棘手問題，歡迎在評論區(qū)留言，我們一起探討解決方案～
關(guān)注我們了解更多內(nèi)容
OLS OMNI Life Science認證的中國授權(quán)經(jīng)銷商：
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