DNA甲基化在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育和疾病中的多種重要作用
DNA甲基化參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、X染色體失活、基因印記和腫瘤的發(fā)生，對(duì)哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育至關(guān)重要，近年來(lái)更被發(fā)現(xiàn)是解碼衰老機(jī)制的關(guān)鍵“時(shí)鐘”。DNA甲基化水平隨齡動(dòng)態(tài)變化，其異常既可驅(qū)動(dòng)干細(xì)胞耗竭、線粒體功能障礙等衰老標(biāo)志，也可作為預(yù)測(cè)個(gè)體生物學(xué)年齡的指標(biāo)，為衰老干預(yù)提供可量化的時(shí)間窗口。近日，法國(guó)巴黎文理研究大學(xué)居里研究所Maxim V. C. Greenberg和Deborah Bourc’his在《Nature Reviews Molecular Cell Biology》上發(fā)表題為《The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease》的深度綜述。文章從DNA甲基化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)、DNA甲基化相關(guān)基因在DNA甲基化過(guò)程中的作用及疾病中的可能機(jī)制等方面，討論了在富含CpG的啟動(dòng)子、基因體和轉(zhuǎn)座元件中，小鼠和人類(lèi)DNA甲基化和去甲基化的機(jī)制和功能，強(qiáng)調(diào)了在胚胎、生殖細(xì)胞系和體細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中DNA甲基化的時(shí)序性去除和再建立，并對(duì)復(fù)雜疾病的表觀遺傳基因突變關(guān)聯(lián)進(jìn)行了闡述。
本文深入剖析了DNA甲基化在哺乳動(dòng)物發(fā)育與疾病中的多重角色，為表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域提供了前沿且全面的視角。不僅闡釋了DNA甲基化在基因調(diào)控、轉(zhuǎn)座元件沉默及基因組穩(wěn)定性中的關(guān)鍵作用，還揭示了其在胚胎發(fā)育、生殖細(xì)胞系分化等過(guò)程中的時(shí)序性變化與復(fù)雜機(jī)制力。此外，對(duì)表觀遺傳基因突變與復(fù)雜疾病關(guān)系（包括理解衰老的發(fā)生機(jī)制）的解讀，為臨床診斷與治療提供了理論基礎(chǔ)。
（DOI:10.1038/s41580-019-0159-6）
一、DNA甲基化的細(xì)胞功能
（1）甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶" writers "與去甲基化酶" erasers "
DNA甲基化過(guò)程分為de novo甲基化（建立）、維持和去甲基化三個(gè)階段。
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶“writers”
DNMT3A和DNMT3B：兩種主要的de novo DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases, DNMTs），其包含高度保守的DNMT域（MTase domain）和兩個(gè)染色質(zhì)read域：ATRX-DNMT3-DNMT3L（ADD）和PWWP域(圖1a,b；表1)。ADD域可與H3K4me3結(jié)合，其與H3K4的甲基化程度呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)H3K4未甲基化時(shí)，ADD域釋放MTase域的自抑制，從而允許DNA甲基化發(fā)生；PWWP域能與H3K36me3結(jié)合，這表明轉(zhuǎn)錄與基因體（gene body）的DNA甲基化之間存在機(jī)制聯(lián)系。
DNMT3L：是一種無(wú)催化活性的DNMT，它與DNMT3A和DNMT3B相互作用并特異性地在生殖細(xì)胞系中刺激它們的活性。
DNMT1：是維持DNA甲基化的關(guān)鍵酶，其活性依賴于UHRF1蛋白。UHRF1通過(guò)其SRA域特異性結(jié)合復(fù)制叉上的半甲基化CpG二核苷酸，還通過(guò)TTD-PHD域結(jié)合H3K9me2和H3K9me3。UHRF1通過(guò)其UBL域招募DNMT1，釋放其自抑制狀態(tài)，使DNMT1能夠結(jié)合RFTS并甲基化子代DNA鏈。
DNA去甲基化酶" erasers "
TET蛋白（TET methylcytosine dioxygenases）：是主動(dòng)DNA去甲基化的執(zhí)行蛋白，其逐步將5mC氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），這些氧化產(chǎn)物都能在復(fù)制過(guò)程中促進(jìn)DNA去甲基化，5fC和5caC還可以通過(guò)TDG介導(dǎo)的堿基切除修復(fù)通路發(fā)生去甲基化。
b.基因體區(qū)域的DNA甲基化。在基因體中，ADD域通過(guò)結(jié)合未甲基化的H3K4釋放DNMT3的自抑制。活躍轉(zhuǎn)錄基因的基因體內(nèi)富含H3K36me3修飾，該修飾通過(guò)DNMT3的PWWP域招募甲基化酶，促進(jìn)基因體甲基化。
c.DNA甲基化的維持機(jī)制。左圖：E3泛素連接酶UHRF1通過(guò)其SRA域（識(shí)別半甲基化CpG位點(diǎn)）和TTD域（結(jié)合H3K9me2）被招募至復(fù)制中的DNA。UHRF1的RING域泛素化修飾組蛋白H3尾部（Ub）。DNMT1的復(fù)制焦點(diǎn)靶向序列（RFTS）折疊至MTase域，抑制其催化活性。UHRF1通過(guò)其泛素樣（UBL）域與DNMT1的RFTS互作，招募DNMT1。右圖：當(dāng)RFTS結(jié)合泛素化H3尾部時(shí)，DNMT1的自抑制解除，從而維持CpG位點(diǎn)的對(duì)稱性甲基化。
（2）DNA甲基化轉(zhuǎn)錄抑制
DNA甲基化與基因沉默之間的相關(guān)性隨著啟動(dòng)子區(qū)域CpG二核苷酸密度的增加而增強(qiáng)，但DNA甲基化本身并不直接導(dǎo)致沉默，它可能通過(guò)以下幾種方式抑制轉(zhuǎn)錄：
阻礙轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合：某些轉(zhuǎn)錄因子對(duì)CpG甲基化敏感，甲基化的CpG位點(diǎn)會(huì)阻止這些轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合，從而阻礙轉(zhuǎn)錄激活。例如，研究發(fā)現(xiàn)22%的人類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)合甲基化的DNA時(shí)親和力降低。
招募染色質(zhì)重塑和修飾因子：DNMT蛋白可以與染色質(zhì)重塑因子和修飾因子相互作用，形成異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致基因沉默。例如，DNMTs與淋巴細(xì)胞特異性螺旋酶（LSH）、H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙�；傅刃纬蓮�(fù)合物，促進(jìn)基因沉默。
與MBD蛋白互作：哺乳動(dòng)物有五種MBD蛋白（MBD1-MBD4和MeCP2），它們與核小體重塑和組蛋白去乙�；笍�(fù)合物相互作用，導(dǎo)致基因沉默。其中，除了MBD3外，其他MBD蛋白對(duì)CpG甲基化的結(jié)合能力隨CpG甲基化程度的增加而增加。
b.基因體區(qū)域的DNA甲基化。在基因體中，ADD域通過(guò)結(jié)合未甲基化的H3K4釋放DNMT3的自抑制。活躍轉(zhuǎn)錄基因的基因體內(nèi)富含H3K36me3修飾，該修飾通過(guò)DNMT3的PWWP域招募甲基化酶，促進(jìn)基因體甲基化。
c.DNA甲基化的維持機(jī)制。左圖：E3泛素連接酶UHRF1通過(guò)其SRA域（識(shí)別半甲基化CpG位點(diǎn)）和TTD域（結(jié)合H3K9me2）被招募至復(fù)制中的DNA。UHRF1的RING域泛素化修飾組蛋白H3尾部（Ub）。DNMT1的復(fù)制焦點(diǎn)靶向序列（RFTS）折疊至MTase域，抑制其催化活性。UHRF1通過(guò)其泛素樣（UBL）域與DNMT1的RFTS互作，招募DNMT1。右圖：當(dāng)RFTS結(jié)合泛素化H3尾部時(shí)，DNMT1的自抑制解除，從而維持CpG位點(diǎn)的對(duì)稱性甲基化。
（2）DNA甲基化轉(zhuǎn)錄抑制
DNA甲基化與基因沉默之間的相關(guān)性隨著啟動(dòng)子區(qū)域CpG二核苷酸密度的增加而增強(qiáng)，但DNA甲基化本身并不直接導(dǎo)致沉默，它可能通過(guò)以下幾種方式抑制轉(zhuǎn)錄：
阻礙轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合：某些轉(zhuǎn)錄因子對(duì)CpG甲基化敏感，甲基化的CpG位點(diǎn)會(huì)阻止這些轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合，從而阻礙轉(zhuǎn)錄激活。例如，研究發(fā)現(xiàn)22%的人類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)合甲基化的DNA時(shí)親和力降低。
招募染色質(zhì)重塑和修飾因子：DNMT蛋白可以與染色質(zhì)重塑因子和修飾因子相互作用，形成異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致基因沉默。例如，DNMTs與淋巴細(xì)胞特異性螺旋酶（LSH）、H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙酰化酶等形成復(fù)合物，促進(jìn)基因沉默。
與MBD蛋白互作：哺乳動(dòng)物有五種MBD蛋白（MBD1-MBD4和MeCP2），它們與核小體重塑和組蛋白去乙�；笍�(fù)合物相互作用，導(dǎo)致基因沉默。其中，除了MBD3外，其他MBD蛋白對(duì)CpG甲基化的結(jié)合能力隨CpG甲基化程度的增加而增加。
（3）CpG島啟動(dòng)子(CpG-island promoters)
CpG島（CGIs）是哺乳動(dòng)物基因組中相對(duì)較短的基因組區(qū)域，平均約1kb，其CpG含量較高，超過(guò)三分之二的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子是CGIs，幾乎所有管家基因和一些發(fā)育調(diào)控基因都有CGI啟動(dòng)子。CGIs通常很少發(fā)生甲基化，尤其是在分裂的雄性生殖細(xì)胞系中，它們未被CpG侵蝕，保留了較高的CpG含量。
X-chromosome inactivation（X染色體失活）：在雌性哺乳動(dòng)物中，每個(gè)細(xì)胞中的一條X染色體會(huì)被隨機(jī)沉默，這一過(guò)程由非編碼RNA X- inactive specific transcript（XIST）在順式（in cis）中發(fā)揮作用。在X染色體失活過(guò)程中，DNA甲基化出現(xiàn)在相對(duì)較晚的階段，作為基因沉默后的最終鎖定機(jī)制。在小鼠中，X連鎖CGI啟動(dòng)子的沉默主要依賴于DNMT3B，而SMCHD1在部分X連鎖CGI中也發(fā)揮重要作用，但其在人類(lèi)中與DNA甲基化的聯(lián)系尚未明確。
Genomic imprinting（基因組印記）：基因組印記是指在兩個(gè)親本生殖細(xì)胞系中差異性地建立DNA甲基化模式，這些印記模式能夠抵抗早期胚胎發(fā)育過(guò)程中DNA甲基化的重編程。在小鼠和人類(lèi)中，大約有20個(gè)基因組印記調(diào)控區(qū)域（ICRs）能夠抵抗這種重編程，從而強(qiáng)制相鄰基因單等位表達(dá)。ICRs大多在卵子中被甲基化，且都與極富CpG的CGIs重合，而三個(gè)父本ICRs則位于CpG貧乏的基因間序列中。在卵母細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，DNMT3A在DNMT3L的輔助下以轉(zhuǎn)錄依賴性方式甲基化卵母細(xì)胞表達(dá)基因的基因體，包括其內(nèi)含的CGIs（圖2b），而基因組的其余部分則保持低甲基化狀態(tài)。哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄通常從位于典型CGI啟動(dòng)子上游的替代啟動(dòng)子發(fā)出，這些啟動(dòng)子通常與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件序列重合。
母本(也包括父本)ICRs與其他在配子中被甲基化的序列區(qū)別在于它們富含特定的遺傳motif(TGCCGC)，這些motif在發(fā)生甲基化時(shí)會(huì)被KRAB鋅指蛋白57(ZFP57)識(shí)別。ZFP57招募KRAB相關(guān)蛋白1(KAP1，也稱為T(mén)IF1β)和其他沉默因子，包括DNMTs�？傊�，母本印記CGI能夠發(fā)生DNA甲基化，依賴于卵母細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄譜和特定的遺傳序列的共同作用。
Germline-specific genes（生殖細(xì)胞系特異性基因）：CGI啟動(dòng)子的生殖細(xì)胞系特異性基因通過(guò)DNMT3B介導(dǎo)的DNA甲基化在胚胎植入后隨著體細(xì)胞分化開(kāi)始被沉默。與大多數(shù)未甲基化的CpG富集啟動(dòng)子不同，生殖細(xì)胞系CGIs進(jìn)化出了序列特異性地招募DNA甲基化機(jī)制以確保終體細(xì)胞沉默的方式(圖2c)。
b.母源印記的建立。在生長(zhǎng)中的卵母細(xì)胞中，DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄延伸過(guò)程密切相關(guān)，依賴DNMT3A-DNMT3L復(fù)合體。小鼠受精后，印記啟動(dòng)子通過(guò)結(jié)合鋅指蛋白57（ZFP57）-KRAB相關(guān)蛋白1（KAP1）復(fù)合體上的甲基化TGCCGC motif，抵抗早期胚胎的整體去甲基化。該復(fù)合體招募組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1及維持甲基化因子DNMT1和UHRF1，從而維持基因沉默。
c.生殖細(xì)胞系基因CGI啟動(dòng)子的甲基化模型。部分生殖細(xì)胞系基因被非經(jīng)典多梳抑制復(fù)合體PRC1.6結(jié)合，該復(fù)合體包含L3MBTL2，可招募異二聚體H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶G9a-GLP。
（4）利用重復(fù)基因組
基因組防御轉(zhuǎn)座元件被認(rèn)為是DNA甲基化進(jìn)化的驅(qū)動(dòng)力之一，哺乳動(dòng)物基因組中DNA甲基化的主要靶標(biāo)不是基因而是轉(zhuǎn)座元件，尤其是逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件。小鼠和人類(lèi)基因組中有數(shù)百萬(wàn)個(gè)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件拷貝，占據(jù)了大約一半的基因組空間。在小鼠Dnmt1敲除胚胎中，內(nèi)源性A粒子（IAP）逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件被大量去抑制，導(dǎo)致嚴(yán)重的發(fā)育缺陷和胚胎致死(圖3a)。
DNMT3C是一種新發(fā)現(xiàn)的de novo DNMT，它在小鼠和大鼠的Muroidea譜系中通過(guò)串聯(lián)重復(fù)Dnmt3b基因起源。DNMT3C在雄性胎兒生殖細(xì)胞系中特異性表達(dá)，它選擇性地甲基化和抑制進(jìn)化上年輕的轉(zhuǎn)座元件啟動(dòng)子，這些轉(zhuǎn)座元件僅占小鼠基因組的1%。Dnmt3c突變小鼠表現(xiàn)出小睪丸和不育，其分子表型與生殖細(xì)胞系甲基化輔助因子Dnmt3l的突變體以及piRNA通路的突變體相同，piRNA通路是一類(lèi)專(zhuān)門(mén)用于在生殖細(xì)胞系中沉默轉(zhuǎn)座元件的高度保守的小RNA。
除了短期內(nèi)抑制轉(zhuǎn)座元件表達(dá)外，DNA甲基化還通過(guò)脫氨基引起的突變促進(jìn)它們的不可逆遺傳失活。此外，DNA甲基化可能通過(guò)限制非等位轉(zhuǎn)座元件拷貝之間的重組來(lái)維持基因組穩(wěn)定性，這一可能性得到了各種人類(lèi)癌癥中DNA低甲基化與染色體重排（大多涉及轉(zhuǎn)座元件）之間正相關(guān)的支持。
圖3：基于DNA甲基化的轉(zhuǎn)座元件調(diào)控機(jī)制
a.體內(nèi)DNA甲基化缺失對(duì)轉(zhuǎn)座元件的功能作用。在小鼠胚胎中，DNMT1缺失會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)A顆粒（IAP）逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件的顯著上調(diào)，并伴隨嚴(yán)重的發(fā)育缺陷和胚胎期9.5天（E9.5）的致死性。Dnmt3C或Dnmt3L突變體會(huì)導(dǎo)致睪丸縮小，并在雄性生殖細(xì)胞系中特異性喪失IAP和LINE1轉(zhuǎn)座元件的DNA甲基化，進(jìn)而引發(fā)減數(shù)分裂災(zāi)難和不育。
b.piRNA介導(dǎo)的小鼠DNA甲基化模型。由轉(zhuǎn)座元件轉(zhuǎn)錄本生成的piRNA會(huì)裝載到MIWI2（即PIWIL4）上并定位至細(xì)胞核，通過(guò)未知機(jī)制招募DNMT3C-DNMT3L復(fù)合體。由于DNMT3C含有染色質(zhì)read的ADD域，可能存在一種機(jī)制（如通過(guò)賴氨酸去甲基化酶去除H3K4me3）來(lái)規(guī)避H3K4me3基因激活效應(yīng)。
c.小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中DNA甲基化缺失的補(bǔ)償機(jī)制。當(dāng)ESCs從高甲基化培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換至低甲基化培養(yǎng)基時(shí)，轉(zhuǎn)座元件可分為三類(lèi)：H3K9甲基化未受干擾，但H3K27me3侵入轉(zhuǎn)座元件主體（A類(lèi)）；H3K9甲基化保持不變（B類(lèi)）；表觀沉默機(jī)制從H3K9甲基化切換為H3K27me3依賴性沉默（C類(lèi)）。
d.UHRF1在半甲基化DNA中阻止SETDB1介導(dǎo)的IAP沉默。在條件性敲除Dnmt1的胚胎中，UHRF1持續(xù)結(jié)合復(fù)制后的半甲基化DNA，阻止H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1沉默IAP轉(zhuǎn)座元件。這一機(jī)制在野生型小鼠胎盤(pán)中具有生理意義：UHRF1結(jié)合半甲基化DNA導(dǎo)致IAP去抑制；而在Uhrf1突變的ESCs和胎盤(pán)中，SETDB1催化H3K9三甲基化，從而抑制IAP活性。
（5）基因體的謎團(tuán)
基因體中DNA甲基化的富集提出了一個(gè)悖論：一方面，基因體甲基化在真核生物中高度保守，其保守程度甚至超過(guò)轉(zhuǎn)座元件；另一方面，DNA甲基化具有誘變性，那么為什么它在編碼序列中如此突出？重要的是，基因體DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄呈正相關(guān)，因此其作用與基因沉默無(wú)關(guān)。關(guān)于基因體中DNA甲基化功能的兩個(gè)假設(shè)被提出：一是促進(jìn)轉(zhuǎn)錄延伸和/或共轉(zhuǎn)錄剪切，二是其抑制基因內(nèi)隱性啟動(dòng)子。
轉(zhuǎn)錄延伸和剪切：DNA甲基化在基因體中的分布與外顯子富集有關(guān)，可能影響RNA聚合酶II（Pol II）的進(jìn)程和剪切。例如，在人類(lèi)CD45基因中，CCCTC結(jié)合因子（CTCF）減緩?fù)怙@子5處的RNA聚合酶II延伸速率，從而促進(jìn)其包含；DNA甲基化則阻止CTCF結(jié)合，導(dǎo)致外顯子排除。相反，在其他位點(diǎn)，DNA甲基化可以通過(guò)招募MeCP2來(lái)促進(jìn)外顯子包含，這與觀察到的替代外顯子平均甲基化水平低于組成性外顯子的事實(shí)一致。
抑制隱秘啟動(dòng)子：這一假設(shè)與DNA甲基化作為轉(zhuǎn)錄抑制因子的功能一致。如上所述，de novo DNA甲基化機(jī)制通過(guò)結(jié)合H3K36me3被招募到DNA上，而H3K36me3在釀酒酵母中已知可防止隱秘啟動(dòng)子的使用。然而，基因體中的內(nèi)源性CGIs通常在小鼠和人類(lèi)之間是保守的，其更可能是替代啟動(dòng)子而非隱秘啟動(dòng)子。最近的一項(xiàng)研究顯示，DNMT3B介導(dǎo)的基因體DNA甲基化限制了H3K36me3下游隱秘啟動(dòng)子活性，但這種效應(yīng)在細(xì)胞群體中只在極小比例的細(xì)胞中觀察到。此外，Dnmt三敲除胚胎干細(xì)胞（ESCs）并未表現(xiàn)出與Dnmt3B單突變細(xì)胞相同的內(nèi)源性隱秘啟動(dòng)子抑制。
二、發(fā)育中的甲基化模式
（1）早期胚胎和生殖細(xì)胞系
整體被動(dòng)和主動(dòng)去甲基化與局部de novo甲基化
生殖細(xì)胞系重編程過(guò)程中，DNA去甲基化伴隨著原始生殖細(xì)胞系(PGCs)獲得生殖細(xì)胞系特性的兩個(gè)階段。第一階段包括基因組大部分區(qū)域的被動(dòng)去甲基化作為默認(rèn)通路。隨后是TET1和TET2依賴性去甲基化，主要影響印記位點(diǎn)和生殖細(xì)胞系特異性基因(圖4a)，并與小鼠PGCs細(xì)胞核中5hmC的出現(xiàn)相吻合。
在受精后的重編程中，胚胎在向多能性發(fā)展過(guò)程中失去了從卵母細(xì)胞和精子遺傳的親本特異性DNA甲基化模式，這一過(guò)程也分為兩個(gè)階段。在小鼠單細(xì)胞期胚胎(受精卵)中，TET3介導(dǎo)的5hmC的出現(xiàn)和5mC的丟失同時(shí)發(fā)生，表明父本基因組最初通過(guò)TET3主動(dòng)去甲基化；隨后兩個(gè)親本基因組經(jīng)歷幾輪被動(dòng)的、DNA復(fù)制依賴性DNA甲基化稀釋?zhuān)驗(yàn)槁涯讣?xì)胞提供的維持酶DNMT1在隨后的細(xì)胞分裂中被排除在細(xì)胞核外(圖4a)。然而最近的全基因組亞硫酸鹽測(cè)序分析顯示，母本甲基化組在受精卵中也經(jīng)歷了有限的TET3依賴性氧化。其他研究還表明，大多數(shù)受精卵DNA甲基化的丟失與復(fù)制無(wú)關(guān)，在父本基因組中，這可能以TET3非依賴性方式通過(guò)未知機(jī)制發(fā)生。
單細(xì)胞全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（scWGBS）揭示了人類(lèi)胚胎基因組在進(jìn)行整體去甲基化時(shí)普遍發(fā)生的de novo DNA甲基化：首先在單細(xì)胞階段的副本基因組中，然后在8細(xì)胞階段全基因組范圍內(nèi)發(fā)生，與胚胎基因組激活同時(shí)發(fā)生，主要靶向轉(zhuǎn)座元件。在小鼠發(fā)育過(guò)程中，一些de novo DNA甲基化也可能與胚胎或生殖細(xì)胞系基因組的整體去甲基化同時(shí)發(fā)生。
人類(lèi)胚胎的DNA甲基化變化與小鼠相似，但也存在一些物種特異性差異。人類(lèi)胚胎的初始快速去甲基化主要影響父本基因組，但發(fā)生在受精到2細(xì)胞階段，而小鼠則在單細(xì)胞階段完成。隨后，人類(lèi)胚胎的全基因組DNA甲基化逐漸丟失，直到囊胚階段，但與小鼠相比，人類(lèi)母本基因組在囊胚階段保留了更高的DNA甲基化水平。
b.Zdbf2位點(diǎn)的瞬時(shí)印記。植入前發(fā)育中，Zdbf2的長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本（Liz）呈現(xiàn)印記狀態(tài)：母源等位基因甲基化沉默，父源等位基因未甲基化且表達(dá)。兩等位基因的啟動(dòng)子均通過(guò)Polycomb介導(dǎo)的H3K27me3沉默。植入后，父源Liz的表達(dá)誘導(dǎo)其啟動(dòng)子上游區(qū)域甲基化并驅(qū)逐H3K27me3，而母源等位基因仍受H3K27me3抑制。盡管Liz的印記短暫，但父源位點(diǎn)植入后的甲基化通過(guò)拮抗Polycomb抑制，實(shí)現(xiàn)Zdbf2的終身印記表達(dá)。若胚胎中Zdbf2激活失敗，將導(dǎo)致出生后生長(zhǎng)缺陷。
c.組織特異性增強(qiáng)子的甲基化變化。體細(xì)胞中，調(diào)控元件的DNA甲基化呈現(xiàn)時(shí)序性變化。TET酶與轉(zhuǎn)錄因子（TF）協(xié)作介導(dǎo)去甲基化并激活增強(qiáng)子；而失活的增強(qiáng)子因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合減少，更易被de novo甲基化酶靶向。
d.神經(jīng)元中CpA甲基化的作用。出生后，DNMT3A在基因體沉積甲基化。甲基化的CAC序列（mCAC）被MeCP2識(shí)別，其結(jié)合可建立基因沉默的終身表觀遺傳記憶。
甲基化重編程及其抵抗的生物學(xué)意義
盡管胚胎和生殖細(xì)胞系去甲基化是全局性，但在兩個(gè)過(guò)程結(jié)束時(shí)，仍有相當(dāng)一部分DNA甲基化得以保留。這一現(xiàn)象引發(fā)了關(guān)于代際表觀遺傳繼承甚至跨代表觀遺傳繼承的可能猜想。
在植入前胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中，小鼠和人類(lèi)中約20%的CpGs保留了配子遺傳的甲基化(圖4a)。這些位點(diǎn)顯著定位到ICRs，與通過(guò)KRAB-ZFP招募KAP1的序列特異性DNA去甲基化抵抗有關(guān)。然而，ICRs在基因組中所占比例微不足道。除了這些經(jīng)典的ICRs外，還有數(shù)百個(gè)"瞬時(shí)"甲基化印記：這些主要從卵母細(xì)胞遺傳，通過(guò)類(lèi)似于經(jīng)典ICRs的KRAB-ZFP依賴性保護(hù)，保持母系特異性DNA甲基化直到囊胚階段，并在植入后通過(guò)DNA甲基化或再甲基化丟失。這種現(xiàn)象在人類(lèi)中可能尤為普遍，人類(lèi)母本基因組在植入前以及植入后（僅在胎盤(pán)組織中）保留了比父本基因組更高的DNA甲基化水平。對(duì)Zdbf2位點(diǎn)的研究表明，父本等位基因的短暫低甲基化可以通過(guò)一系列下游表觀遺傳變化引起長(zhǎng)期的印記，從而影響出生后大小。
在囊胚階段，基因組中抵抗重編程的大部分殘余配子甲基化與單拷貝序列無(wú)關(guān)，而是與轉(zhuǎn)座元件有關(guān)。在小鼠中，年輕的IAP類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件對(duì)植入前甲基化特別抵抗。在人類(lèi)囊胚中，進(jìn)化上年輕的、可能活躍的轉(zhuǎn)座元件，特別是靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物特有的SINE-VNTR-Alu元件，保留了最高的DNA甲基化水平。DNA甲基化通過(guò)KRAB-ZFP介導(dǎo)的KAP1序列特異性招募保留，類(lèi)似于KAP1在ICRs中的選擇性DNA結(jié)合。KRAB-ZFPs需要時(shí)間來(lái)發(fā)展對(duì)最近出現(xiàn)的轉(zhuǎn)座元件的匹配，因此最新的IAP元件(通常在小鼠品系之間多態(tài))在植入前發(fā)育過(guò)程中不能抵抗DNA甲基化重編程。
與植入前發(fā)育相比，生殖細(xì)胞系去甲基化更為廣泛。到小鼠胚胎發(fā)生的第13.5天，PGCs的CpGs甲基化水平僅為6%-8% (圖4a)。人類(lèi)胎兒生殖細(xì)胞系在懷孕9周后也保留了類(lèi)似的基線水平。與胚胎發(fā)育相反，ICRs在發(fā)育中的PGCs中進(jìn)行甲基化，作為隨后在雄性和雌性生殖細(xì)胞系分化過(guò)程中獲得性別特異性DNA甲基化模式的先決條件。與植入前發(fā)育中的甲基化重編程類(lèi)似，生殖細(xì)胞系DNA甲基化的保留主要在年輕且潛在有害的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件中觀察到。
（2）De novo DNA甲基化程序
在PGCs中重編程后，雄性和雌性生殖細(xì)胞系中建立了性別特異性的DNA甲基化模式。在配子發(fā)生結(jié)束時(shí)，精子基因組表現(xiàn)出約80%的CpG甲基化，而卵子基因組僅約50%被甲基化，且?guī)缀踔辉诨蝮w中(圖4a)。卵母細(xì)胞的相對(duì)低甲基化與DNMT1在細(xì)胞質(zhì)中的保留有關(guān)，這是由于STELLA蛋白將UHRF1隔離在細(xì)胞質(zhì)中的次級(jí)效應(yīng)。在Stella突變卵母細(xì)胞中，DNMT1進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致異位DNA甲基化沉積，DNA甲基化增加兩倍，導(dǎo)致雌性不育。這表明DNMT1在卵母細(xì)胞中能夠進(jìn)行de novo DNA甲基化，而在胚胎細(xì)胞中則不然。
在胚胎重編程結(jié)束時(shí)(小鼠胚胎第4.5天)，囊胚由內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(將形成外胚層然后形成胚胎組織)和滋養(yǎng)外胚層及原始內(nèi)胚層組成。兩項(xiàng)全基因組分析研究證實(shí)，與外胚層相比，胚外外胚層(ExE)和內(nèi)臟內(nèi)胚層都是低甲基化的(圖4a)。DNA低甲基化在主要由ExE細(xì)胞分化而來(lái)的胎盤(pán)組織中持續(xù)存在。低甲基化與與外胚層相比DNMT3表達(dá)減少相關(guān)，甚至逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件也相對(duì)低甲基化。相比之下，ExE和內(nèi)臟內(nèi)胚層中甲基化但外胚層中未甲基化的一組特定CGI啟動(dòng)子。其甲基化增加要么反映了在胚外組織中需要保持被抑制，要么表明胚胎組織有更嚴(yán)格的機(jī)制來(lái)防止異常的DNA甲基化和長(zhǎng)期沉默。
大腦在體細(xì)胞組織中表現(xiàn)出特殊的甲基化組。在小鼠和人類(lèi)中，出生后CpA甲基化激增，由DNMT3A產(chǎn)生。神經(jīng)組織中總CpA甲基化水平與CpG甲基化大致相當(dāng)，mCpA頻率低于mCpG。MBD蛋白MeCP2結(jié)合年輕小鼠神經(jīng)元基因體中的mCAC序列，MeCP2的結(jié)合在生命后期保持這些基因的沉默(圖4d)。這一機(jī)制可以幫助理解DNA甲基化，特別是非CpG甲基化在調(diào)節(jié)神經(jīng)和行為特征中的作用。
三、表觀遺傳基因突變與復(fù)雜疾病的關(guān)系
（1）DNMT1與神經(jīng)系統(tǒng)疾病
DNMT1的雜合突變與一系列常染色體顯性遺傳的進(jìn)行性認(rèn)知和行為退化疾病有關(guān)，包括伴有癡呆和聽(tīng)力損失的遺傳性感覺(jué)自主神經(jīng)病1E(HSAN1E)和伴有耳聾和發(fā)作性睡病的常染色體顯性小腦共濟(jì)失調(diào)(ADAC-DN)(表1)。
所有DNMT1突變都發(fā)生在RFTS域，導(dǎo)致DNA甲基化模式的輕微變化。對(duì)HSAN1E或ADAC-DN個(gè)體外周血的全基因組分析結(jié)果顯示主要表現(xiàn)為基因間區(qū)域的低甲基化和一些CGIs的高甲基化。這些DNA甲基化特征可作為可獲取細(xì)胞類(lèi)型中的病理生物標(biāo)志物，但其不一定與疾病的大腦特異性表現(xiàn)相關(guān)。
（2）DNMT3B與免疫缺陷
免疫缺陷、著絲粒不穩(wěn)定和面部異常綜合征(ICF綜合征)是第一個(gè)與先天性DNA甲基化缺陷相關(guān)的遺傳疾病(表1)。ICF的診斷通常包括染色體1、9和16的多放射狀染色體，與著絲粒周?chē)l(wèi)星重復(fù)序列II和III的特異性低甲基化相關(guān)。DNMT3B基因的隱性突變定義了ICF1，占ICF病例的大多數(shù)。正如小鼠Dnmt3B功能缺失突變模型致死性所預(yù)期的，大多數(shù)ICF1突變導(dǎo)致單個(gè)氨基酸替換或缺失，被認(rèn)為導(dǎo)致DNMT3B活性降低而非完全喪失。
ICF1患者特異性表現(xiàn)出生殖細(xì)胞系基因和X連鎖基因的CGI啟動(dòng)子低甲基化，這與DNMT3B在小鼠發(fā)育過(guò)程中靶向這些序列一致，并表明這種靶向可能獨(dú)立于ZBTB14、CDCA7和LSH發(fā)生。相比之下，ICF2、ICF3和ICF4與ICF1的區(qū)別在于著絲粒α衛(wèi)星重復(fù)序列和神經(jīng)基因簇的低甲基化。這可能暗示ZBTB14、CDCA7和LSH在招募除DNMT3B外的其他DNMT到這些序列中的作用。
（3）DNMT3A、細(xì)胞生長(zhǎng)和惡性腫瘤
雜合性、生殖細(xì)胞系DNMT3A突變與早產(chǎn)前生長(zhǎng)障礙相關(guān)，具體表現(xiàn)取決于突變的性質(zhì)。錯(cuò)義、獲得性功能突變?cè)赑WWP域中被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致微頭侏儒癥，這是一種表現(xiàn)為身體和頭部尺寸顯著但成比例減小的病理狀態(tài)。在小鼠中引入PWWP功能獲得性突變顯著再現(xiàn)了小頭畸形矮小癥的身體大小和腦重量減少以及異位甲基化表型。
相比之下，雜合性DNMT3A單倍體不足突變特征為T(mén)atton-Brown–Rahman綜合征（TBRS，也稱為DNMT3A過(guò)度生長(zhǎng)綜合征），表現(xiàn)為大頭畸形和輕度智力障礙(表1)。TRBS突變發(fā)生在DNMT3A基因各處，包括PWWP域(功能獲得性突變上游)、ADD域和MTase域。這些突變對(duì)DNA甲基化模式的影響尚未確定。
最后，體細(xì)胞DNMT3A突變與未成熟髓系細(xì)胞增殖增強(qiáng)和成人血液惡性腫瘤的發(fā)展相關(guān)。這些突變?cè)诩s15-35%的急性髓系白血病(AML)病例中發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)是MTase域中精氨酸882(R882)的錯(cuò)義突變。
（4）TET2的DNA羥甲基化與癌癥
雖然體細(xì)胞DNMT3A活性喪失在AML中相當(dāng)常見(jiàn)，但TET2突變是血液惡性腫瘤更常見(jiàn)的原因，包括急性髓系白血�。ˋML）、慢性粒單核細(xì)胞白血病、淋巴瘤和骨髓增殖性腫瘤(表1)。TET2突變導(dǎo)致的5hmC含量降低，可能通過(guò)影響基因調(diào)控和其他細(xì)胞過(guò)程，導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。
在DNMT3A突變癌細(xì)胞中，由于可用于TET2的5mC減少，5hmC也預(yù)期會(huì)減少。因此，5hmC修飾可能是惡性腫瘤的罪魁禍?zhǔn)祝ㄟ^(guò)影響基因調(diào)控和/或通過(guò)招募5hmC reader的其他細(xì)胞過(guò)程。最近一項(xiàng)對(duì)Dnmt3A和Tet2雙突變小鼠的研究說(shuō)明了這兩種酶之間的復(fù)雜上位性，涉及協(xié)同、競(jìng)爭(zhēng)和獨(dú)立活動(dòng)的組合。
體細(xì)胞SDH基因突變?cè)谖改c道間質(zhì)瘤和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(副神經(jīng)節(jié)瘤和嗜鉻細(xì)胞瘤)中發(fā)現(xiàn)，與富馬酸和琥珀酸的細(xì)胞內(nèi)水平升高、TET2活性抑制以及CGIs內(nèi)外的廣泛高甲基化相關(guān)，類(lèi)似于IDH突變�？傊�，與DNA甲基化和去甲基化因子突變相關(guān)的疾病提供了對(duì)這些蛋白質(zhì)功能的細(xì)致理解。這些領(lǐng)域的持續(xù)研究有望為癌癥和遺傳疾病帶來(lái)治療突破。
四、結(jié)論與未來(lái)展望
盡管在理解DNA甲基化機(jī)制和模式方面取得了重大進(jìn)展，但仍有許多未知之處。例如，為什么缺乏DNA甲基化的胚胎會(huì)在發(fā)育早期死亡？是由于編碼蛋白基因的異常表達(dá)、轉(zhuǎn)座元件的大規(guī)模去抑制、基因組不穩(wěn)定性，還是其他未知的原因？
隨著基因編輯技術(shù)、高靈敏度測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，以及對(duì)DNA甲基化時(shí)序性動(dòng)態(tài)變化的精確測(cè)量能力提升，許多傳統(tǒng)上難以解決的問(wèn)題現(xiàn)在似乎可以得到初步答案，然而，挑戰(zhàn)依然存在，例如需要對(duì)特定細(xì)胞類(lèi)型或發(fā)育階段的DNA甲基化模式進(jìn)行序列特異性的定量分析，以了解在衰老和腫瘤發(fā)生過(guò)程中可能出現(xiàn)的不平衡。
未來(lái)的研究將繼續(xù)探索DNA甲基化的功能，特別是在早期胚胎和生殖細(xì)胞系中的廣泛去甲基化是否對(duì)多能性建立至關(guān)重要。此外，對(duì)非傳統(tǒng)模式生物的研究將繼續(xù)提供關(guān)于保守機(jī)制和功能的寶貴見(jiàn)解。
參考文獻(xiàn)：
Greenberg MVC, Bourc'his D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Oct;20(10):590-607. doi: 10.1038/s41580-019-0159-6.
本文深入剖析了DNA甲基化在哺乳動(dòng)物發(fā)育與疾病中的多重角色，為表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域提供了前沿且全面的視角。不僅闡釋了DNA甲基化在基因調(diào)控、轉(zhuǎn)座元件沉默及基因組穩(wěn)定性中的關(guān)鍵作用，還揭示了其在胚胎發(fā)育、生殖細(xì)胞系分化等過(guò)程中的時(shí)序性變化與復(fù)雜機(jī)制力。此外，對(duì)表觀遺傳基因突變與復(fù)雜疾病關(guān)系（包括理解衰老的發(fā)生機(jī)制）的解讀，為臨床診斷與治療提供了理論基礎(chǔ)。
一、DNA甲基化的細(xì)胞功能
（1）甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶" writers "與去甲基化酶" erasers "
DNA甲基化過(guò)程分為de novo甲基化（建立）、維持和去甲基化三個(gè)階段。
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶“writers”
DNMT3A和DNMT3B：兩種主要的de novo DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases, DNMTs），其包含高度保守的DNMT域（MTase domain）和兩個(gè)染色質(zhì)read域：ATRX-DNMT3-DNMT3L（ADD）和PWWP域(圖1a,b；表1)。ADD域可與H3K4me3結(jié)合，其與H3K4的甲基化程度呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)H3K4未甲基化時(shí)，ADD域釋放MTase域的自抑制，從而允許DNA甲基化發(fā)生；PWWP域能與H3K36me3結(jié)合，這表明轉(zhuǎn)錄與基因體（gene body）的DNA甲基化之間存在機(jī)制聯(lián)系。
DNMT3L：是一種無(wú)催化活性的DNMT，它與DNMT3A和DNMT3B相互作用并特異性地在生殖細(xì)胞系中刺激它們的活性。
DNMT1：是維持DNA甲基化的關(guān)鍵酶，其活性依賴于UHRF1蛋白。UHRF1通過(guò)其SRA域特異性結(jié)合復(fù)制叉上的半甲基化CpG二核苷酸，還通過(guò)TTD-PHD域結(jié)合H3K9me2和H3K9me3。UHRF1通過(guò)其UBL域招募DNMT1，釋放其自抑制狀態(tài)，使DNMT1能夠結(jié)合RFTS并甲基化子代DNA鏈。
DNA去甲基化酶" erasers "
TET蛋白（TET methylcytosine dioxygenases）：是主動(dòng)DNA去甲基化的執(zhí)行蛋白，其逐步將5mC氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），這些氧化產(chǎn)物都能在復(fù)制過(guò)程中促進(jìn)DNA去甲基化，5fC和5caC還可以通過(guò)TDG介導(dǎo)的堿基切除修復(fù)通路發(fā)生去甲基化。
圖1：DNA甲基化的分子機(jī)制與作用過(guò)程。
a.啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化機(jī)制。左圖：H3K4me3是活性或待激活啟動(dòng)子的標(biāo)志，其阻止DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A/3B（DNMT3A/3B）及DNMT3L的ADD域與染色質(zhì)結(jié)合，從而迫使ADD與甲基轉(zhuǎn)移酶（MTase）域結(jié)合，抑制DNMT3酶活性。右圖：當(dāng)H3K4未甲基化時(shí)，ADD域與H3K4結(jié)合，解除DNMT3的自抑制狀態(tài)，使MTase域能夠催化DNA甲基化。b.基因體區(qū)域的DNA甲基化。在基因體中，ADD域通過(guò)結(jié)合未甲基化的H3K4釋放DNMT3的自抑制。活躍轉(zhuǎn)錄基因的基因體內(nèi)富含H3K36me3修飾，該修飾通過(guò)DNMT3的PWWP域招募甲基化酶，促進(jìn)基因體甲基化。
c.DNA甲基化的維持機(jī)制。左圖：E3泛素連接酶UHRF1通過(guò)其SRA域（識(shí)別半甲基化CpG位點(diǎn)）和TTD域（結(jié)合H3K9me2）被招募至復(fù)制中的DNA。UHRF1的RING域泛素化修飾組蛋白H3尾部（Ub）。DNMT1的復(fù)制焦點(diǎn)靶向序列（RFTS）折疊至MTase域，抑制其催化活性。UHRF1通過(guò)其泛素樣（UBL）域與DNMT1的RFTS互作，招募DNMT1。右圖：當(dāng)RFTS結(jié)合泛素化H3尾部時(shí)，DNMT1的自抑制解除，從而維持CpG位點(diǎn)的對(duì)稱性甲基化。
（2）DNA甲基化轉(zhuǎn)錄抑制
DNA甲基化與基因沉默之間的相關(guān)性隨著啟動(dòng)子區(qū)域CpG二核苷酸密度的增加而增強(qiáng)，但DNA甲基化本身并不直接導(dǎo)致沉默，它可能通過(guò)以下幾種方式抑制轉(zhuǎn)錄：
阻礙轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合：某些轉(zhuǎn)錄因子對(duì)CpG甲基化敏感，甲基化的CpG位點(diǎn)會(huì)阻止這些轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合，從而阻礙轉(zhuǎn)錄激活。例如，研究發(fā)現(xiàn)22%的人類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)合甲基化的DNA時(shí)親和力降低。
招募染色質(zhì)重塑和修飾因子：DNMT蛋白可以與染色質(zhì)重塑因子和修飾因子相互作用，形成異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致基因沉默。例如，DNMTs與淋巴細(xì)胞特異性螺旋酶（LSH）、H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙�；傅刃纬蓮�(fù)合物，促進(jìn)基因沉默。
與MBD蛋白互作：哺乳動(dòng)物有五種MBD蛋白（MBD1-MBD4和MeCP2），它們與核小體重塑和組蛋白去乙�；笍�(fù)合物相互作用，導(dǎo)致基因沉默。其中，除了MBD3外，其他MBD蛋白對(duì)CpG甲基化的結(jié)合能力隨CpG甲基化程度的增加而增加。
圖1：DNA甲基化的分子機(jī)制與作用過(guò)程。
a.啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化機(jī)制。左圖：H3K4me3是活性或待激活啟動(dòng)子的標(biāo)志，其阻止DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A/3B（DNMT3A/3B）及DNMT3L的ADD域與染色質(zhì)結(jié)合，從而迫使ADD與甲基轉(zhuǎn)移酶（MTase）域結(jié)合，抑制DNMT3酶活性。右圖：當(dāng)H3K4未甲基化時(shí)，ADD域與H3K4結(jié)合，解除DNMT3的自抑制狀態(tài)，使MTase域能夠催化DNA甲基化。b.基因體區(qū)域的DNA甲基化。在基因體中，ADD域通過(guò)結(jié)合未甲基化的H3K4釋放DNMT3的自抑制。活躍轉(zhuǎn)錄基因的基因體內(nèi)富含H3K36me3修飾，該修飾通過(guò)DNMT3的PWWP域招募甲基化酶，促進(jìn)基因體甲基化。
c.DNA甲基化的維持機(jī)制。左圖：E3泛素連接酶UHRF1通過(guò)其SRA域（識(shí)別半甲基化CpG位點(diǎn)）和TTD域（結(jié)合H3K9me2）被招募至復(fù)制中的DNA。UHRF1的RING域泛素化修飾組蛋白H3尾部（Ub）。DNMT1的復(fù)制焦點(diǎn)靶向序列（RFTS）折疊至MTase域，抑制其催化活性。UHRF1通過(guò)其泛素樣（UBL）域與DNMT1的RFTS互作，招募DNMT1。右圖：當(dāng)RFTS結(jié)合泛素化H3尾部時(shí)，DNMT1的自抑制解除，從而維持CpG位點(diǎn)的對(duì)稱性甲基化。
（2）DNA甲基化轉(zhuǎn)錄抑制
DNA甲基化與基因沉默之間的相關(guān)性隨著啟動(dòng)子區(qū)域CpG二核苷酸密度的增加而增強(qiáng)，但DNA甲基化本身并不直接導(dǎo)致沉默，它可能通過(guò)以下幾種方式抑制轉(zhuǎn)錄：
阻礙轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合：某些轉(zhuǎn)錄因子對(duì)CpG甲基化敏感，甲基化的CpG位點(diǎn)會(huì)阻止這些轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合，從而阻礙轉(zhuǎn)錄激活。例如，研究發(fā)現(xiàn)22%的人類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)合甲基化的DNA時(shí)親和力降低。
招募染色質(zhì)重塑和修飾因子：DNMT蛋白可以與染色質(zhì)重塑因子和修飾因子相互作用，形成異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致基因沉默。例如，DNMTs與淋巴細(xì)胞特異性螺旋酶（LSH）、H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙酰化酶等形成復(fù)合物，促進(jìn)基因沉默。
與MBD蛋白互作：哺乳動(dòng)物有五種MBD蛋白（MBD1-MBD4和MeCP2），它們與核小體重塑和組蛋白去乙�；笍�(fù)合物相互作用，導(dǎo)致基因沉默。其中，除了MBD3外，其他MBD蛋白對(duì)CpG甲基化的結(jié)合能力隨CpG甲基化程度的增加而增加。
表1：DNA甲基化和去甲基化因子及其功能
（3）CpG島啟動(dòng)子(CpG-island promoters)
CpG島（CGIs）是哺乳動(dòng)物基因組中相對(duì)較短的基因組區(qū)域，平均約1kb，其CpG含量較高，超過(guò)三分之二的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子是CGIs，幾乎所有管家基因和一些發(fā)育調(diào)控基因都有CGI啟動(dòng)子。CGIs通常很少發(fā)生甲基化，尤其是在分裂的雄性生殖細(xì)胞系中，它們未被CpG侵蝕，保留了較高的CpG含量。
X-chromosome inactivation（X染色體失活）：在雌性哺乳動(dòng)物中，每個(gè)細(xì)胞中的一條X染色體會(huì)被隨機(jī)沉默，這一過(guò)程由非編碼RNA X- inactive specific transcript（XIST）在順式（in cis）中發(fā)揮作用。在X染色體失活過(guò)程中，DNA甲基化出現(xiàn)在相對(duì)較晚的階段，作為基因沉默后的最終鎖定機(jī)制。在小鼠中，X連鎖CGI啟動(dòng)子的沉默主要依賴于DNMT3B，而SMCHD1在部分X連鎖CGI中也發(fā)揮重要作用，但其在人類(lèi)中與DNA甲基化的聯(lián)系尚未明確。
Genomic imprinting（基因組印記）：基因組印記是指在兩個(gè)親本生殖細(xì)胞系中差異性地建立DNA甲基化模式，這些印記模式能夠抵抗早期胚胎發(fā)育過(guò)程中DNA甲基化的重編程。在小鼠和人類(lèi)中，大約有20個(gè)基因組印記調(diào)控區(qū)域（ICRs）能夠抵抗這種重編程，從而強(qiáng)制相鄰基因單等位表達(dá)。ICRs大多在卵子中被甲基化，且都與極富CpG的CGIs重合，而三個(gè)父本ICRs則位于CpG貧乏的基因間序列中。在卵母細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，DNMT3A在DNMT3L的輔助下以轉(zhuǎn)錄依賴性方式甲基化卵母細(xì)胞表達(dá)基因的基因體，包括其內(nèi)含的CGIs（圖2b），而基因組的其余部分則保持低甲基化狀態(tài)。哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄通常從位于典型CGI啟動(dòng)子上游的替代啟動(dòng)子發(fā)出，這些啟動(dòng)子通常與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件序列重合。
母本(也包括父本)ICRs與其他在配子中被甲基化的序列區(qū)別在于它們富含特定的遺傳motif(TGCCGC)，這些motif在發(fā)生甲基化時(shí)會(huì)被KRAB鋅指蛋白57(ZFP57)識(shí)別。ZFP57招募KRAB相關(guān)蛋白1(KAP1，也稱為T(mén)IF1β)和其他沉默因子，包括DNMTs�？傊�，母本印記CGI能夠發(fā)生DNA甲基化，依賴于卵母細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄譜和特定的遺傳序列的共同作用。
Germline-specific genes（生殖細(xì)胞系特異性基因）：CGI啟動(dòng)子的生殖細(xì)胞系特異性基因通過(guò)DNMT3B介導(dǎo)的DNA甲基化在胚胎植入后隨著體細(xì)胞分化開(kāi)始被沉默。與大多數(shù)未甲基化的CpG富集啟動(dòng)子不同，生殖細(xì)胞系CGIs進(jìn)化出了序列特異性地招募DNA甲基化機(jī)制以確保終體細(xì)胞沉默的方式(圖2c)。
圖2：CGI啟動(dòng)子的DNA甲基化靶向機(jī)制
a.X染色體失活中SMCHD1依賴的CGI de novo甲基化。SMCHD1形成同源二聚體，可能通過(guò)凝聚失活X染色體的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)揮作用。在部分CGI區(qū)域，SMCHD1通過(guò)未知機(jī)制介導(dǎo)DNMT3B催化的DNA甲基化。b.母源印記的建立。在生長(zhǎng)中的卵母細(xì)胞中，DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄延伸過(guò)程密切相關(guān)，依賴DNMT3A-DNMT3L復(fù)合體。小鼠受精后，印記啟動(dòng)子通過(guò)結(jié)合鋅指蛋白57（ZFP57）-KRAB相關(guān)蛋白1（KAP1）復(fù)合體上的甲基化TGCCGC motif，抵抗早期胚胎的整體去甲基化。該復(fù)合體招募組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1及維持甲基化因子DNMT1和UHRF1，從而維持基因沉默。
c.生殖細(xì)胞系基因CGI啟動(dòng)子的甲基化模型。部分生殖細(xì)胞系基因被非經(jīng)典多梳抑制復(fù)合體PRC1.6結(jié)合，該復(fù)合體包含L3MBTL2，可招募異二聚體H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶G9a-GLP。
（4）利用重復(fù)基因組
基因組防御轉(zhuǎn)座元件被認(rèn)為是DNA甲基化進(jìn)化的驅(qū)動(dòng)力之一，哺乳動(dòng)物基因組中DNA甲基化的主要靶標(biāo)不是基因而是轉(zhuǎn)座元件，尤其是逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件。小鼠和人類(lèi)基因組中有數(shù)百萬(wàn)個(gè)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件拷貝，占據(jù)了大約一半的基因組空間。在小鼠Dnmt1敲除胚胎中，內(nèi)源性A粒子（IAP）逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件被大量去抑制，導(dǎo)致嚴(yán)重的發(fā)育缺陷和胚胎致死(圖3a)。
DNMT3C是一種新發(fā)現(xiàn)的de novo DNMT，它在小鼠和大鼠的Muroidea譜系中通過(guò)串聯(lián)重復(fù)Dnmt3b基因起源。DNMT3C在雄性胎兒生殖細(xì)胞系中特異性表達(dá)，它選擇性地甲基化和抑制進(jìn)化上年輕的轉(zhuǎn)座元件啟動(dòng)子，這些轉(zhuǎn)座元件僅占小鼠基因組的1%。Dnmt3c突變小鼠表現(xiàn)出小睪丸和不育，其分子表型與生殖細(xì)胞系甲基化輔助因子Dnmt3l的突變體以及piRNA通路的突變體相同，piRNA通路是一類(lèi)專(zhuān)門(mén)用于在生殖細(xì)胞系中沉默轉(zhuǎn)座元件的高度保守的小RNA。
除了短期內(nèi)抑制轉(zhuǎn)座元件表達(dá)外，DNA甲基化還通過(guò)脫氨基引起的突變促進(jìn)它們的不可逆遺傳失活。此外，DNA甲基化可能通過(guò)限制非等位轉(zhuǎn)座元件拷貝之間的重組來(lái)維持基因組穩(wěn)定性，這一可能性得到了各種人類(lèi)癌癥中DNA低甲基化與染色體重排（大多涉及轉(zhuǎn)座元件）之間正相關(guān)的支持。
圖3：基于DNA甲基化的轉(zhuǎn)座元件調(diào)控機(jī)制
b.piRNA介導(dǎo)的小鼠DNA甲基化模型。由轉(zhuǎn)座元件轉(zhuǎn)錄本生成的piRNA會(huì)裝載到MIWI2（即PIWIL4）上并定位至細(xì)胞核，通過(guò)未知機(jī)制招募DNMT3C-DNMT3L復(fù)合體。由于DNMT3C含有染色質(zhì)read的ADD域，可能存在一種機(jī)制（如通過(guò)賴氨酸去甲基化酶去除H3K4me3）來(lái)規(guī)避H3K4me3基因激活效應(yīng)。
c.小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中DNA甲基化缺失的補(bǔ)償機(jī)制。當(dāng)ESCs從高甲基化培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換至低甲基化培養(yǎng)基時(shí)，轉(zhuǎn)座元件可分為三類(lèi)：H3K9甲基化未受干擾，但H3K27me3侵入轉(zhuǎn)座元件主體（A類(lèi)）；H3K9甲基化保持不變（B類(lèi)）；表觀沉默機(jī)制從H3K9甲基化切換為H3K27me3依賴性沉默（C類(lèi)）。
d.UHRF1在半甲基化DNA中阻止SETDB1介導(dǎo)的IAP沉默。在條件性敲除Dnmt1的胚胎中，UHRF1持續(xù)結(jié)合復(fù)制后的半甲基化DNA，阻止H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1沉默IAP轉(zhuǎn)座元件。這一機(jī)制在野生型小鼠胎盤(pán)中具有生理意義：UHRF1結(jié)合半甲基化DNA導(dǎo)致IAP去抑制；而在Uhrf1突變的ESCs和胎盤(pán)中，SETDB1催化H3K9三甲基化，從而抑制IAP活性。
（5）基因體的謎團(tuán)
基因體中DNA甲基化的富集提出了一個(gè)悖論：一方面，基因體甲基化在真核生物中高度保守，其保守程度甚至超過(guò)轉(zhuǎn)座元件；另一方面，DNA甲基化具有誘變性，那么為什么它在編碼序列中如此突出？重要的是，基因體DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄呈正相關(guān)，因此其作用與基因沉默無(wú)關(guān)。關(guān)于基因體中DNA甲基化功能的兩個(gè)假設(shè)被提出：一是促進(jìn)轉(zhuǎn)錄延伸和/或共轉(zhuǎn)錄剪切，二是其抑制基因內(nèi)隱性啟動(dòng)子。
轉(zhuǎn)錄延伸和剪切：DNA甲基化在基因體中的分布與外顯子富集有關(guān)，可能影響RNA聚合酶II（Pol II）的進(jìn)程和剪切。例如，在人類(lèi)CD45基因中，CCCTC結(jié)合因子（CTCF）減緩?fù)怙@子5處的RNA聚合酶II延伸速率，從而促進(jìn)其包含；DNA甲基化則阻止CTCF結(jié)合，導(dǎo)致外顯子排除。相反，在其他位點(diǎn)，DNA甲基化可以通過(guò)招募MeCP2來(lái)促進(jìn)外顯子包含，這與觀察到的替代外顯子平均甲基化水平低于組成性外顯子的事實(shí)一致。
抑制隱秘啟動(dòng)子：這一假設(shè)與DNA甲基化作為轉(zhuǎn)錄抑制因子的功能一致。如上所述，de novo DNA甲基化機(jī)制通過(guò)結(jié)合H3K36me3被招募到DNA上，而H3K36me3在釀酒酵母中已知可防止隱秘啟動(dòng)子的使用。然而，基因體中的內(nèi)源性CGIs通常在小鼠和人類(lèi)之間是保守的，其更可能是替代啟動(dòng)子而非隱秘啟動(dòng)子。最近的一項(xiàng)研究顯示，DNMT3B介導(dǎo)的基因體DNA甲基化限制了H3K36me3下游隱秘啟動(dòng)子活性，但這種效應(yīng)在細(xì)胞群體中只在極小比例的細(xì)胞中觀察到。此外，Dnmt三敲除胚胎干細(xì)胞（ESCs）并未表現(xiàn)出與Dnmt3B單突變細(xì)胞相同的內(nèi)源性隱秘啟動(dòng)子抑制。
二、發(fā)育中的甲基化模式
（1）早期胚胎和生殖細(xì)胞系
整體被動(dòng)和主動(dòng)去甲基化與局部de novo甲基化
生殖細(xì)胞系重編程過(guò)程中，DNA去甲基化伴隨著原始生殖細(xì)胞系(PGCs)獲得生殖細(xì)胞系特性的兩個(gè)階段。第一階段包括基因組大部分區(qū)域的被動(dòng)去甲基化作為默認(rèn)通路。隨后是TET1和TET2依賴性去甲基化，主要影響印記位點(diǎn)和生殖細(xì)胞系特異性基因(圖4a)，并與小鼠PGCs細(xì)胞核中5hmC的出現(xiàn)相吻合。
在受精后的重編程中，胚胎在向多能性發(fā)展過(guò)程中失去了從卵母細(xì)胞和精子遺傳的親本特異性DNA甲基化模式，這一過(guò)程也分為兩個(gè)階段。在小鼠單細(xì)胞期胚胎(受精卵)中，TET3介導(dǎo)的5hmC的出現(xiàn)和5mC的丟失同時(shí)發(fā)生，表明父本基因組最初通過(guò)TET3主動(dòng)去甲基化；隨后兩個(gè)親本基因組經(jīng)歷幾輪被動(dòng)的、DNA復(fù)制依賴性DNA甲基化稀釋?zhuān)驗(yàn)槁涯讣?xì)胞提供的維持酶DNMT1在隨后的細(xì)胞分裂中被排除在細(xì)胞核外(圖4a)。然而最近的全基因組亞硫酸鹽測(cè)序分析顯示，母本甲基化組在受精卵中也經(jīng)歷了有限的TET3依賴性氧化。其他研究還表明，大多數(shù)受精卵DNA甲基化的丟失與復(fù)制無(wú)關(guān)，在父本基因組中，這可能以TET3非依賴性方式通過(guò)未知機(jī)制發(fā)生。
單細(xì)胞全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（scWGBS）揭示了人類(lèi)胚胎基因組在進(jìn)行整體去甲基化時(shí)普遍發(fā)生的de novo DNA甲基化：首先在單細(xì)胞階段的副本基因組中，然后在8細(xì)胞階段全基因組范圍內(nèi)發(fā)生，與胚胎基因組激活同時(shí)發(fā)生，主要靶向轉(zhuǎn)座元件。在小鼠發(fā)育過(guò)程中，一些de novo DNA甲基化也可能與胚胎或生殖細(xì)胞系基因組的整體去甲基化同時(shí)發(fā)生。
人類(lèi)胚胎的DNA甲基化變化與小鼠相似，但也存在一些物種特異性差異。人類(lèi)胚胎的初始快速去甲基化主要影響父本基因組，但發(fā)生在受精到2細(xì)胞階段，而小鼠則在單細(xì)胞階段完成。隨后，人類(lèi)胚胎的全基因組DNA甲基化逐漸丟失，直到囊胚階段，但與小鼠相比，人類(lèi)母本基因組在囊胚階段保留了更高的DNA甲基化水平。
圖4：發(fā)育過(guò)程中的DNA甲基化重編程
a.胚胎與生殖細(xì)胞系DNA甲基化的去除與重建。甲基胞嘧啶雙加氧酶TET3在受精卵中激活，催化羥甲基化并介導(dǎo)主動(dòng)DNA去甲基化。隨后通過(guò)被動(dòng)去甲基化（虛線表示），DNA甲基化水平在囊胚階段降至最低；囊胚植入后，由DNMT3A和DNMT3B介導(dǎo)的de novo甲基化重新建立甲基化模式。DNMT3L在此階段雖表達(dá)，但對(duì)胚胎基因組甲基化非絕對(duì)必需。在胚胎外組織中，DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L表達(dá)量低于胚胎本體，導(dǎo)致相對(duì)低甲基化狀態(tài)。植入后，外胚層中部分干細(xì)胞分化為生殖細(xì)胞系細(xì)胞，經(jīng)歷兩波去甲基化：被動(dòng)去甲基化及TET1/TET2介導(dǎo)的主動(dòng)去甲基化。雄配子在出生前通過(guò)DNMT3A和DNMT3L（小鼠等嚙齒類(lèi)還需DNMT3C）實(shí)現(xiàn)高甲基化；雌配子在減數(shù)分裂后、排卵前通過(guò)DNMT3A和DNMT3L（人類(lèi)可能僅需DNMT3A）完成甲基化。b.Zdbf2位點(diǎn)的瞬時(shí)印記。植入前發(fā)育中，Zdbf2的長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本（Liz）呈現(xiàn)印記狀態(tài)：母源等位基因甲基化沉默，父源等位基因未甲基化且表達(dá)。兩等位基因的啟動(dòng)子均通過(guò)Polycomb介導(dǎo)的H3K27me3沉默。植入后，父源Liz的表達(dá)誘導(dǎo)其啟動(dòng)子上游區(qū)域甲基化并驅(qū)逐H3K27me3，而母源等位基因仍受H3K27me3抑制。盡管Liz的印記短暫，但父源位點(diǎn)植入后的甲基化通過(guò)拮抗Polycomb抑制，實(shí)現(xiàn)Zdbf2的終身印記表達(dá)。若胚胎中Zdbf2激活失敗，將導(dǎo)致出生后生長(zhǎng)缺陷。
c.組織特異性增強(qiáng)子的甲基化變化。體細(xì)胞中，調(diào)控元件的DNA甲基化呈現(xiàn)時(shí)序性變化。TET酶與轉(zhuǎn)錄因子（TF）協(xié)作介導(dǎo)去甲基化并激活增強(qiáng)子；而失活的增強(qiáng)子因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合減少，更易被de novo甲基化酶靶向。
d.神經(jīng)元中CpA甲基化的作用。出生后，DNMT3A在基因體沉積甲基化。甲基化的CAC序列（mCAC）被MeCP2識(shí)別，其結(jié)合可建立基因沉默的終身表觀遺傳記憶。
甲基化重編程及其抵抗的生物學(xué)意義
盡管胚胎和生殖細(xì)胞系去甲基化是全局性，但在兩個(gè)過(guò)程結(jié)束時(shí)，仍有相當(dāng)一部分DNA甲基化得以保留。這一現(xiàn)象引發(fā)了關(guān)于代際表觀遺傳繼承甚至跨代表觀遺傳繼承的可能猜想。
在植入前胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中，小鼠和人類(lèi)中約20%的CpGs保留了配子遺傳的甲基化(圖4a)。這些位點(diǎn)顯著定位到ICRs，與通過(guò)KRAB-ZFP招募KAP1的序列特異性DNA去甲基化抵抗有關(guān)。然而，ICRs在基因組中所占比例微不足道。除了這些經(jīng)典的ICRs外，還有數(shù)百個(gè)"瞬時(shí)"甲基化印記：這些主要從卵母細(xì)胞遺傳，通過(guò)類(lèi)似于經(jīng)典ICRs的KRAB-ZFP依賴性保護(hù)，保持母系特異性DNA甲基化直到囊胚階段，并在植入后通過(guò)DNA甲基化或再甲基化丟失。這種現(xiàn)象在人類(lèi)中可能尤為普遍，人類(lèi)母本基因組在植入前以及植入后（僅在胎盤(pán)組織中）保留了比父本基因組更高的DNA甲基化水平。對(duì)Zdbf2位點(diǎn)的研究表明，父本等位基因的短暫低甲基化可以通過(guò)一系列下游表觀遺傳變化引起長(zhǎng)期的印記，從而影響出生后大小。
在囊胚階段，基因組中抵抗重編程的大部分殘余配子甲基化與單拷貝序列無(wú)關(guān)，而是與轉(zhuǎn)座元件有關(guān)。在小鼠中，年輕的IAP類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件對(duì)植入前甲基化特別抵抗。在人類(lèi)囊胚中，進(jìn)化上年輕的、可能活躍的轉(zhuǎn)座元件，特別是靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物特有的SINE-VNTR-Alu元件，保留了最高的DNA甲基化水平。DNA甲基化通過(guò)KRAB-ZFP介導(dǎo)的KAP1序列特異性招募保留，類(lèi)似于KAP1在ICRs中的選擇性DNA結(jié)合。KRAB-ZFPs需要時(shí)間來(lái)發(fā)展對(duì)最近出現(xiàn)的轉(zhuǎn)座元件的匹配，因此最新的IAP元件(通常在小鼠品系之間多態(tài))在植入前發(fā)育過(guò)程中不能抵抗DNA甲基化重編程。
與植入前發(fā)育相比，生殖細(xì)胞系去甲基化更為廣泛。到小鼠胚胎發(fā)生的第13.5天，PGCs的CpGs甲基化水平僅為6%-8% (圖4a)。人類(lèi)胎兒生殖細(xì)胞系在懷孕9周后也保留了類(lèi)似的基線水平。與胚胎發(fā)育相反，ICRs在發(fā)育中的PGCs中進(jìn)行甲基化，作為隨后在雄性和雌性生殖細(xì)胞系分化過(guò)程中獲得性別特異性DNA甲基化模式的先決條件。與植入前發(fā)育中的甲基化重編程類(lèi)似，生殖細(xì)胞系DNA甲基化的保留主要在年輕且潛在有害的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件中觀察到。
（2）De novo DNA甲基化程序
在PGCs中重編程后，雄性和雌性生殖細(xì)胞系中建立了性別特異性的DNA甲基化模式。在配子發(fā)生結(jié)束時(shí)，精子基因組表現(xiàn)出約80%的CpG甲基化，而卵子基因組僅約50%被甲基化，且?guī)缀踔辉诨蝮w中(圖4a)。卵母細(xì)胞的相對(duì)低甲基化與DNMT1在細(xì)胞質(zhì)中的保留有關(guān)，這是由于STELLA蛋白將UHRF1隔離在細(xì)胞質(zhì)中的次級(jí)效應(yīng)。在Stella突變卵母細(xì)胞中，DNMT1進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致異位DNA甲基化沉積，DNA甲基化增加兩倍，導(dǎo)致雌性不育。這表明DNMT1在卵母細(xì)胞中能夠進(jìn)行de novo DNA甲基化，而在胚胎細(xì)胞中則不然。
在胚胎重編程結(jié)束時(shí)(小鼠胚胎第4.5天)，囊胚由內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(將形成外胚層然后形成胚胎組織)和滋養(yǎng)外胚層及原始內(nèi)胚層組成。兩項(xiàng)全基因組分析研究證實(shí)，與外胚層相比，胚外外胚層(ExE)和內(nèi)臟內(nèi)胚層都是低甲基化的(圖4a)。DNA低甲基化在主要由ExE細(xì)胞分化而來(lái)的胎盤(pán)組織中持續(xù)存在。低甲基化與與外胚層相比DNMT3表達(dá)減少相關(guān)，甚至逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件也相對(duì)低甲基化。相比之下，ExE和內(nèi)臟內(nèi)胚層中甲基化但外胚層中未甲基化的一組特定CGI啟動(dòng)子。其甲基化增加要么反映了在胚外組織中需要保持被抑制，要么表明胚胎組織有更嚴(yán)格的機(jī)制來(lái)防止異常的DNA甲基化和長(zhǎng)期沉默。
大腦在體細(xì)胞組織中表現(xiàn)出特殊的甲基化組。在小鼠和人類(lèi)中，出生后CpA甲基化激增，由DNMT3A產(chǎn)生。神經(jīng)組織中總CpA甲基化水平與CpG甲基化大致相當(dāng)，mCpA頻率低于mCpG。MBD蛋白MeCP2結(jié)合年輕小鼠神經(jīng)元基因體中的mCAC序列，MeCP2的結(jié)合在生命后期保持這些基因的沉默(圖4d)。這一機(jī)制可以幫助理解DNA甲基化，特別是非CpG甲基化在調(diào)節(jié)神經(jīng)和行為特征中的作用。
三、表觀遺傳基因突變與復(fù)雜疾病的關(guān)系
（1）DNMT1與神經(jīng)系統(tǒng)疾病
DNMT1的雜合突變與一系列常染色體顯性遺傳的進(jìn)行性認(rèn)知和行為退化疾病有關(guān)，包括伴有癡呆和聽(tīng)力損失的遺傳性感覺(jué)自主神經(jīng)病1E(HSAN1E)和伴有耳聾和發(fā)作性睡病的常染色體顯性小腦共濟(jì)失調(diào)(ADAC-DN)(表1)。
所有DNMT1突變都發(fā)生在RFTS域，導(dǎo)致DNA甲基化模式的輕微變化。對(duì)HSAN1E或ADAC-DN個(gè)體外周血的全基因組分析結(jié)果顯示主要表現(xiàn)為基因間區(qū)域的低甲基化和一些CGIs的高甲基化。這些DNA甲基化特征可作為可獲取細(xì)胞類(lèi)型中的病理生物標(biāo)志物，但其不一定與疾病的大腦特異性表現(xiàn)相關(guān)。
（2）DNMT3B與免疫缺陷
免疫缺陷、著絲粒不穩(wěn)定和面部異常綜合征(ICF綜合征)是第一個(gè)與先天性DNA甲基化缺陷相關(guān)的遺傳疾病(表1)。ICF的診斷通常包括染色體1、9和16的多放射狀染色體，與著絲粒周?chē)l(wèi)星重復(fù)序列II和III的特異性低甲基化相關(guān)。DNMT3B基因的隱性突變定義了ICF1，占ICF病例的大多數(shù)。正如小鼠Dnmt3B功能缺失突變模型致死性所預(yù)期的，大多數(shù)ICF1突變導(dǎo)致單個(gè)氨基酸替換或缺失，被認(rèn)為導(dǎo)致DNMT3B活性降低而非完全喪失。
ICF1患者特異性表現(xiàn)出生殖細(xì)胞系基因和X連鎖基因的CGI啟動(dòng)子低甲基化，這與DNMT3B在小鼠發(fā)育過(guò)程中靶向這些序列一致，并表明這種靶向可能獨(dú)立于ZBTB14、CDCA7和LSH發(fā)生。相比之下，ICF2、ICF3和ICF4與ICF1的區(qū)別在于著絲粒α衛(wèi)星重復(fù)序列和神經(jīng)基因簇的低甲基化。這可能暗示ZBTB14、CDCA7和LSH在招募除DNMT3B外的其他DNMT到這些序列中的作用。
（3）DNMT3A、細(xì)胞生長(zhǎng)和惡性腫瘤
雜合性、生殖細(xì)胞系DNMT3A突變與早產(chǎn)前生長(zhǎng)障礙相關(guān)，具體表現(xiàn)取決于突變的性質(zhì)。錯(cuò)義、獲得性功能突變?cè)赑WWP域中被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致微頭侏儒癥，這是一種表現(xiàn)為身體和頭部尺寸顯著但成比例減小的病理狀態(tài)。在小鼠中引入PWWP功能獲得性突變顯著再現(xiàn)了小頭畸形矮小癥的身體大小和腦重量減少以及異位甲基化表型。
相比之下，雜合性DNMT3A單倍體不足突變特征為T(mén)atton-Brown–Rahman綜合征（TBRS，也稱為DNMT3A過(guò)度生長(zhǎng)綜合征），表現(xiàn)為大頭畸形和輕度智力障礙(表1)。TRBS突變發(fā)生在DNMT3A基因各處，包括PWWP域(功能獲得性突變上游)、ADD域和MTase域。這些突變對(duì)DNA甲基化模式的影響尚未確定。
最后，體細(xì)胞DNMT3A突變與未成熟髓系細(xì)胞增殖增強(qiáng)和成人血液惡性腫瘤的發(fā)展相關(guān)。這些突變?cè)诩s15-35%的急性髓系白血病(AML)病例中發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)是MTase域中精氨酸882(R882)的錯(cuò)義突變。
（4）TET2的DNA羥甲基化與癌癥
雖然體細(xì)胞DNMT3A活性喪失在AML中相當(dāng)常見(jiàn)，但TET2突變是血液惡性腫瘤更常見(jiàn)的原因，包括急性髓系白血�。ˋML）、慢性粒單核細(xì)胞白血病、淋巴瘤和骨髓增殖性腫瘤(表1)。TET2突變導(dǎo)致的5hmC含量降低，可能通過(guò)影響基因調(diào)控和其他細(xì)胞過(guò)程，導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。
在DNMT3A突變癌細(xì)胞中，由于可用于TET2的5mC減少，5hmC也預(yù)期會(huì)減少。因此，5hmC修飾可能是惡性腫瘤的罪魁禍?zhǔn)祝ㄟ^(guò)影響基因調(diào)控和/或通過(guò)招募5hmC reader的其他細(xì)胞過(guò)程。最近一項(xiàng)對(duì)Dnmt3A和Tet2雙突變小鼠的研究說(shuō)明了這兩種酶之間的復(fù)雜上位性，涉及協(xié)同、競(jìng)爭(zhēng)和獨(dú)立活動(dòng)的組合。
體細(xì)胞SDH基因突變?cè)谖改c道間質(zhì)瘤和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(副神經(jīng)節(jié)瘤和嗜鉻細(xì)胞瘤)中發(fā)現(xiàn)，與富馬酸和琥珀酸的細(xì)胞內(nèi)水平升高、TET2活性抑制以及CGIs內(nèi)外的廣泛高甲基化相關(guān)，類(lèi)似于IDH突變�？傊�，與DNA甲基化和去甲基化因子突變相關(guān)的疾病提供了對(duì)這些蛋白質(zhì)功能的細(xì)致理解。這些領(lǐng)域的持續(xù)研究有望為癌癥和遺傳疾病帶來(lái)治療突破。
四、結(jié)論與未來(lái)展望
盡管在理解DNA甲基化機(jī)制和模式方面取得了重大進(jìn)展，但仍有許多未知之處。例如，為什么缺乏DNA甲基化的胚胎會(huì)在發(fā)育早期死亡？是由于編碼蛋白基因的異常表達(dá)、轉(zhuǎn)座元件的大規(guī)模去抑制、基因組不穩(wěn)定性，還是其他未知的原因？
隨著基因編輯技術(shù)、高靈敏度測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，以及對(duì)DNA甲基化時(shí)序性動(dòng)態(tài)變化的精確測(cè)量能力提升，許多傳統(tǒng)上難以解決的問(wèn)題現(xiàn)在似乎可以得到初步答案，然而，挑戰(zhàn)依然存在，例如需要對(duì)特定細(xì)胞類(lèi)型或發(fā)育階段的DNA甲基化模式進(jìn)行序列特異性的定量分析，以了解在衰老和腫瘤發(fā)生過(guò)程中可能出現(xiàn)的不平衡。
未來(lái)的研究將繼續(xù)探索DNA甲基化的功能，特別是在早期胚胎和生殖細(xì)胞系中的廣泛去甲基化是否對(duì)多能性建立至關(guān)重要。此外，對(duì)非傳統(tǒng)模式生物的研究將繼續(xù)提供關(guān)于保守機(jī)制和功能的寶貴見(jiàn)解。
參考文獻(xiàn)：
Greenberg MVC, Bourc'his D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Oct;20(10):590-607. doi: 10.1038/s41580-019-0159-6.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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