共聚焦顯微鏡高分辨率成像揭示腦瘧致血管滲漏新靶點

本研究成果由Livia Piatti, Alina Batzilla, Fumio Nakaki, Hannah Fleckenstein, Francois Korbmacher, Rory K. M. Long, Daniel Schraivogel, John A. Hawkins, Tais Romero-Urunuela, Borja Lopez-Gutiérrez, Silvia Sanz Sender, Yannick Schwab, Lars M. Steinmetz, James Sharpe & Maria Bernabeu共同完成，并以"Plasmodium falciparum egress disrupts endothelial junctions and activates JAK-STAT signaling in a microvascular 3D blood-brain barrier model"為題，于2025年8月在線發(fā)表在《Nature Communications》期刊上。

技術(shù)原理
本研究核心技術(shù)的獨特機制在于構(gòu)建了一個高度仿生的三維微血管系統(tǒng)。該技術(shù)通過軟光刻和注射成型相結(jié)合的方法，在I型膠原水凝膠中預(yù)圖案化生成微流控13×13網(wǎng)格網(wǎng)絡(luò)，創(chuàng)造了復雜的微流體通道結(jié)構(gòu)。

關(guān)鍵技術(shù)原理包含三個創(chuàng)新點：首先采用多細胞共培養(yǎng)策略，將原代人星形膠質(zhì)細胞和腦血管周細胞預(yù)先種植在膠原溶液中，形成支持基質(zhì)，而后在原代人大腦微血管內(nèi)皮細胞在重力驅(qū)動流下接種到微流控網(wǎng)絡(luò)中，形成完整的三維結(jié)構(gòu)；其次利用先進的光學成像技術(shù)進行質(zhì)量驗證，通過共聚焦顯微鏡對特異性標志物（PECAM-1、vWF、VE-cadherin用于內(nèi)皮細胞，PDGFRβ、NG2用于周細胞，GFAP、S100B、AQP4用于星形膠質(zhì)細胞）進行成像，確認各種細胞的正確定位和形態(tài)特征；第三是建立功能評估體系，通過70 kDa FITC-葡聚糖通透性實驗定量評估屏障完整性，證明該模型相比內(nèi)皮細胞單獨培養(yǎng)模型具有顯著降低的通透性（2.15×10⁻⁶ cm/s vs 8.31×10⁻⁶ cm/s），證實其增強的屏障特性。

重要發(fā)現(xiàn)
01三維血腦屏障模型的構(gòu)建與優(yōu)越的屏障特性
研究團隊成功構(gòu)建了一個更接近人體真實生理狀態(tài)的生物工程化3D微血管模型。該模型在I型膠原水凝膠中制造，通過軟光刻和注射成型技術(shù)預(yù)圖案化形成一個微流控網(wǎng)絡(luò)。將原代人星形膠質(zhì)細胞和腦血管周細胞預(yù)先種植在膠原溶液中，再將原代人腦微血管內(nèi)皮細胞在重力驅(qū)動流下接種到微流控網(wǎng)絡(luò)中，從而形成了一個三維共培養(yǎng)體系。經(jīng)過免疫熒光染色鑒定，三種細胞均表達了其特有的標志物：內(nèi)皮細胞表達PECAM-1、vWF、VE-cadherin和β-catenin；周細胞表達PDGFRβ和NG2；星形膠質(zhì)細胞則表達GFAP、S100B和AQP4。共聚焦顯微鏡成像顯示，內(nèi)皮細胞形成了可灌注的微血管，并被星形膠質(zhì)細胞和周細胞包裹，再現(xiàn)了體內(nèi)BBB的三維結(jié)構(gòu)和架構(gòu)。

該模型的關(guān)鍵優(yōu)勢在于其顯著增強的屏障功能。定量RT-PCR測量顯示，與星形膠質(zhì)細胞和周細胞以7:3比例共培養(yǎng)后，內(nèi)皮細胞中BBB特異性標志物的表達隨時間增加，包括緊密連接標志物（OCLN, CLDNs）、BBB轉(zhuǎn)運蛋白（LRP1, SLC家族）和外排泵（PGP, ABC家族），并在培養(yǎng)7天后達到峰值。功能實驗證明，含有周細胞和星形膠質(zhì)細胞的3D-BBB模型對70 kDa FITC-葡聚糖的通透性顯著降低，其通透性值（2.15x10⁻⁶ cm/s）顯著低于僅含內(nèi)皮細胞的模型（8.31x10⁻⁶ cm/s）。這種增強的屏障特性為研究惡性瘧原蟲誘導的血管屏障破壞機制提供了獨特而可靠的平臺。

scRNA-seq分析揭示了暴露于iRBC-逸出介質(zhì)后，三種細胞類型的轉(zhuǎn)錄譜發(fā)生了轉(zhuǎn)變。內(nèi)皮細胞的差異基因表達分析顯示，多個對BBB完整性至關(guān)重要的基因表達顯著降低，包括緊密連接基因CLDN5（Claudin-5）、TJP1（ZO-1）和粘附連接轉(zhuǎn)錄本CDH5（VE-cadherin）�；�因本體（GO-term）富集分析表明，內(nèi)皮細胞中大多數(shù)下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本與內(nèi)皮細胞連接和粘附、細胞骨架組織、血管發(fā)育、DNA修復、染色質(zhì)組織和Wnt信號傳導有關(guān)。

這些轉(zhuǎn)錄變化直接導致了形態(tài)和功能的改變。透射電鏡（TEM）分析顯示，雖然完整細胞接觸區(qū)域的緊密連接長度沒有顯著差異，但暴露于iRBC-逸出介質(zhì)的3D-BBB微血管中，超結(jié)構(gòu)間隙的百分比顯著更高。共聚焦顯微鏡觀察也證實了這一點，VE-cadherin染色顯示出改變的粘附連接模式，表現(xiàn)為連接染色變細和大規(guī)模的內(nèi)皮間縫隙形成。功能上，經(jīng)過24小時處理后，3D-BBB微血管對70 kDa FITC-葡聚糖的微血管通透性比率顯著增加了6.5倍。這些結(jié)果強有力地表明，惡性瘧原蟲-iRBC產(chǎn)物降低了緊密連接和粘附連接標志物的表達，改變了細胞間連接的形態(tài)，并導致了血管屏障完整性的功能損害。

上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本包括參與I型干擾素（IFN）反應(yīng)的基因，如IFIT基因家族成員（IFIT1, IFIT2, IFIT3）、干擾素刺激基因（ISGs）（如ISG15, ISG20）和其他IFN誘導基因（如MX1, IFI6, IFI27, OAS1），以及ferroptosis基因（如HMOX1）。此外，JAK-STAT家族的信號轉(zhuǎn)導子（STAT1, STAT2, JAK2）及其一些相互作用蛋白的轉(zhuǎn)錄本也被上調(diào)。

抗原呈遞是一個在所有BBB組成細胞中強烈 elevated 的重要炎癥相關(guān)過程。TEM證據(jù)顯示內(nèi)皮細胞存在攝取寄生蟲物質(zhì)的跡象，形成了含有iRBC膜或hemozoin的大空泡。免疫熒光染色顯示寄生蟲核酸與溶酶體相關(guān)膜蛋白1（LAMP1）共定位，表明寄生蟲物質(zhì)被運送到了內(nèi)皮細胞的溶酶體區(qū)室。團隊進一步定義了抗原呈遞的轉(zhuǎn)錄組基因特征（MHC I類和MHC II類轉(zhuǎn)錄本）。內(nèi)皮細胞和星形膠質(zhì)細胞均表現(xiàn)出MHC I類基因特征的強勁上調(diào)，而MHC II類抗原呈遞基因特征（與CD4+ T細胞招募相關(guān)）也在內(nèi)皮細胞中強烈上調(diào)，在星形膠質(zhì)細胞和周細胞中適度上調(diào)。

為了更深入了解信號通路的變化，團隊使用了PROGENy計算方法來基于下游基因表達推斷信號通路活性。結(jié)果與GO-term分析一致，觀察到NFkB和TNFα信號在內(nèi)皮細胞和周細胞中的增加。值得注意的是，JAK-STAT通路在所有細胞類型中均被激活。通過免疫熒光染色對STAT1的驗證表明，與對照組相比，暴露于寄生蟲逸出產(chǎn)物后，3D-BBB模型中STAT1表達增加，且不僅發(fā)生在于內(nèi)皮細胞，也發(fā)生在膠原水凝膠中的支持周細胞和星形膠質(zhì)細胞中，表明模型對iRBC-逸出介質(zhì)產(chǎn)生了整體反應(yīng)。在2D單層細胞中進一步評估了STAT1向核的易位，作為通路活性增加的代理指標，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞核STAT1定位增加。

更重要的是，這些形態(tài)學上的改善與3D-BBB屏障功能的改善相關(guān)。通過70 kDa FITC-葡聚糖灌注評估微血管通透性發(fā)現(xiàn)，雖然Ruxolitinib在對照組中僅 modestly 改善了基線通透性，但其在病理條件下的影響更為顯著。與iRBC-逸出介質(zhì)共同孵育導致微血管通透性比單獨使用iRBC-逸出介質(zhì)條件降低了近24倍。這些結(jié)果凸顯了JAK-STAT通路在惡性瘧原蟲介導的屏障破壞中的重要性，并支持了Ruxolitinib在減少與腦瘧疾相關(guān)的腦血管功能障礙方面的治療潛力。

挑戰(zhàn)與展望
當前三維血腦屏障模型雖顯著優(yōu)于傳統(tǒng)模型，但仍面臨多項臨床轉(zhuǎn)化障礙。模型構(gòu)建復雜且需要經(jīng)驗豐富的實驗室進行長期培訓，限制了其廣泛推廣；盡管屏障特性有所改善，但與原生理通透率仍有差距，這主要與原代內(nèi)皮細胞中緊密連接蛋白如Claudin-5和Occludin的固有低表達有關(guān)。

未來研究方向應(yīng)聚焦于技術(shù)優(yōu)化與創(chuàng)新，包括采用誘導多能干細胞（iPSC）來源的腦內(nèi)皮細胞提升屏障性能，但需解決其上皮樣特性問題，通過過表達ETV2、FLI1、ERG等ETS因子或FOXF2和ZIC3等轉(zhuǎn)錄因子可改善血管表型；模型復雜性也需進一步增強，引入小膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元等其他腦細胞類型，以及免疫細胞和血流剪切力等生理因素，以更全面模擬體內(nèi)環(huán)境。

論文信息
聲明：本文僅用作學術(shù)目的。
Piatti L, Batzilla A, Nakaki F, Fleckenstein H, Korbmacher F, Long RKM, Schraivogel D, Hawkins JA, Romero-Uruñuela T, López-Gutiérrez B, Sanz Sender S, Schwab Y, Steinmetz LM, Sharpe J, Bernabeu M. Plasmodium falciparum egress disrupts endothelial junctions and activates JAK-STAT signaling in a microvascular 3D blood-brain barrier model. Nat Commun. 2025 Aug 6;16(1):7262. 

DOI:10.1038/s41467-025-62514-2.