斑馬魚活體熒光實時成像分鐘級動態(tài)捕捉血栓形成與血管發(fā)育

本研究成果由Yuta Imai, Satoru Ozaki, Taiki Noda, Isao Kobayashi, Kayo Sugitani, Satomi Kasashima, Eriko Morishita & Yuhei Araiso共同完成，論文題為《Real-time imaging of blood coagulation and angiogenesis during development in a zebrafish model of type I antithrombin deficiency》，于2025年5月發(fā)表在《Scientific Reports》。

重要發(fā)現(xiàn)
01基因編輯模型的建立與驗證
研究團隊通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向斑馬魚SERPINC1基因外顯子1，成功構(gòu)建了雜合子（zAT+/-）和純合子（zAT-/-）突變體�；�因測序顯示突變導致5個堿基缺失（ACTTA）及單堿基插入（C），造成蛋白質(zhì)框架移位和提前終止。Western blot檢測證實，zAT-/-幼魚血漿中AT蛋白表達量僅為野生型（zAT+/+）的2%，符合I型AT缺乏癥的核心特征——蛋白分泌障礙。

血栓多樣性：在8日齡幼魚中，zAT+/-和zAT-/-組存活率均顯著降低至88%。活體成像顯示，突變體出現(xiàn)心臟內(nèi)血栓、鰭血管（PFV）閉塞及后主靜脈（PCV）血流中斷，嚴重者甚至因全身血管栓塞死亡。

纖維蛋白沉積：免疫熒光染色證實，全身栓塞幼魚的心臟周圍血管存在顯著纖維蛋白沉積，證明凝血級聯(lián)反應的異常激活。

30小時關(guān)鍵期：zAT-/-胚胎的節(jié)間血管（ISV）形成率顯著降低（65.8% vs 野生型82.0%），長度縮短約7%。

5日齡恢復：血管結(jié)構(gòu)最終恢復正常，表明AT缺乏不影響血管最終形態(tài)，這與傳統(tǒng)認知中AT的抗血管生成作用相悖。

基因表達分析進一步揭示生存關(guān)鍵：zAT-/-幼魚通過上調(diào)纖溶酶原（PLG）基因促進血栓溶解，并下調(diào)凝血酶原（F2）基因減少凝血酶生成，形成獨特的抗血栓代償機制。

創(chuàng)新與亮點
01技術(shù)突破：活體血栓動態(tài)成像平臺
本研究首次將CRISPR/Cas9基因編輯與雙熒光標記活體成像技術(shù)結(jié)合，攻克了哺乳動物模型中胚胎致死的觀測難題。通過熒光體視顯微鏡，實現(xiàn)了血栓形成、血管發(fā)育的分鐘級動態(tài)捕捉，為凝血疾病研究提供了高時空分辨率的可視化工具。

總結(jié)與展望
本研究通過創(chuàng)新性基因編輯與活體成像技術(shù)，首次在斑馬魚模型中實現(xiàn)了I型AT缺乏癥的血栓形成與血管發(fā)育實時觀測，突破性地發(fā)現(xiàn)幼魚通過PLG上調(diào)和F2下調(diào)的代償機制存活。這一成果不僅為遺傳性凝血疾病的機制研究提供了全新視角，其建立的實時成像平臺更為抗血栓藥物開發(fā)提供了高效工具。

未來研究方向包括：

1）深入解析PLG/F2基因調(diào)控的分子信號通路；

2）利用該模型篩選靶向代償通路的小分子藥物；

3）探索AT缺乏癥中血管代償與腫瘤血管生成的關(guān)聯(lián)性。

隨著技術(shù)的迭代，活體成像驅(qū)動的斑馬魚模型有望成為凝血疾病從機制研究到臨床轉(zhuǎn)化的核心平臺，為精準醫(yī)療提供新引擎。

DOI:10.1038/s41598-025-01658-z.