拉伸應(yīng)力下調(diào)胚胎干細(xì)胞來源的擬胚體中成骨標(biāo)志物的表達和礦化

Tension Force Stress Downregulates the Expression of Osteogenic Markers and Mineralization in Embryonic Stem-Cell-Derived Embryoid Bodies

Keywords: embryoid body; extracellular signal-regulated kinase; mineralization; osteogenic marker; tensile stress.

擬胚體（EBs）是胚胎干細(xì)胞（ESCs）的3D聚集體，能夠分化成各種譜系細(xì)胞。大量研究結(jié)果表明，EBs與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的協(xié)同應(yīng)用在引導(dǎo)組織再生（GTR）方面具有很大的優(yōu)勢。ECM 成分可以提供調(diào)節(jié) ESCs 和/或 EBs 擴增和分化為特定譜系的線索。因此，具有天然骨ECM成分的支架可以直接增強ESCs的成骨分化和骨形成。

支架本身可以激活各種機械信號，并影響與其纖維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相關(guān)的細(xì)胞行為。牽張應(yīng)變應(yīng)力是暴露于支架上或支架內(nèi)生長的細(xì)胞的主要機械刺激，并調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和/或分化為功能化細(xì)胞的命運。然而，應(yīng)變應(yīng)力對EBs成骨分化和礦化的影響及其相關(guān)機制知之甚少。

點擊了解：牽張應(yīng)變細(xì)胞培養(yǎng)儀

在各種機械傳感分子中，絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs），如細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun N末端激酶（JNK）和p38 MAPK在機械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用。激活的 MAPKs 將外源性機械信號轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，并根據(jù)機械刺激的條件介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活。Wnt/β-catenin 信號也被機械信號激活，并調(diào)節(jié)細(xì)胞向各種譜系細(xì)胞的分化。

基于此，韓國國立全北大學(xué)牙科學(xué)院口腔生物科學(xué)研究所團隊在一項研究中探索了拉伸應(yīng)力如何影響 EBs 的成骨潛力，并研究 β-連環(huán)蛋白或 MAPK 中的哪一個在施加應(yīng)力的 EBs 中充當(dāng)主要機械信號介質(zhì)。研究表明，拉伸負(fù)荷應(yīng)力通過下調(diào)ERK1/RUNX2調(diào)控的信號來抑制EBs的成骨分化和礦化。其成果發(fā)表于 CELLS 期刊題為“Tension Force Stress Downregulates the Expression of Osteogenic Markers and Mineralization in Embryonic Stem-Cell-Derived Embryoid Bodies”。

圖1展示了使用懸滴法從ESCs培養(yǎng)EBs以及使用體外牽張設(shè)備應(yīng)用循環(huán)拉伸應(yīng)力的實驗設(shè)計。首先，在孵育的幾個時間點測定了EBs中多能性相關(guān)標(biāo)記物的水平。EBs中未分化狀態(tài)標(biāo)記物 Oct4和Sox2在第1天EBs中強烈表達，且在第3天EBs中發(fā)現(xiàn)了這種表達。第7 天 EBs 也顯示出與 第1 天相似的 Sox2 表達水平，但 Oct4 的表達水平顯著降低。同時，還檢測了 EBs 在補充或不補充 DAG（二�；�甘油）的培養(yǎng)物中表達成骨轉(zhuǎn)錄因子 RUNX2 和 Osterix 的特性，免疫熒光染色顯示，第3天的EBs表達RUNX2和Osterix，DAG處理后表達明顯增加。

圖1     ESC衍生EBs的拉伸應(yīng)力應(yīng)用實驗設(shè)計。

隨后，通過ARS染色研究了拉伸應(yīng)力如何影響DAG誘導(dǎo)的EBs礦化。與生長培養(yǎng)基中的EB培養(yǎng)物相比，添加DAG的EBs顯示出更多的ARS陽性菌落，但在應(yīng)用于2% 幅度拉伸應(yīng)力的EBs中這種增加有所下降（圖2 A）。ARS特異性光密度（405 nm）的測量支持了DAG誘導(dǎo)的EBs礦化及其因拉伸應(yīng)力而顯著降低的趨勢（圖2 B）。與僅補充DAG的培養(yǎng)物相比，施加拉伸應(yīng)力的培養(yǎng)物中直徑超過300 μm的EBs數(shù)量顯著減少（圖2 C）。此外，補充 DAG的EBs表達的RUNX2、Osterix、BSP和OCN水平顯著提高，但ALP和OPN水平不高（圖2 D）。DAG 刺激的這些成骨基因在 EBs中的表達在拉伸應(yīng)力的協(xié)同作用下被顯著減弱。同樣，免疫印跡測定顯示DAG刺激RUNX2的誘導(dǎo)，并通過拉伸應(yīng)力抑制（圖2 E、F）。這些數(shù)據(jù)表明，循環(huán)拉伸應(yīng)力減少DAG誘導(dǎo)的EBs礦化，這是由成骨調(diào)控分子的下調(diào)所控制的。

圖2    循環(huán)拉伸應(yīng)力抑制DAG刺激的EBs的成骨細(xì)胞分化和成骨標(biāo)志物表達。

接下來，為了了解為什么拉伸應(yīng)力會抑制 DAG 刺激的 EBs 礦化，首先檢查了 EBs 中整合素和 β-連環(huán)蛋白的蛋白質(zhì)水平。與生長培養(yǎng)基提供的對照EBs相比，DAG處理的EBs在全蛋白裂解物中顯示出整合素α5和β1以及β-連環(huán)蛋白的明顯增加，并且在拉伸加載后的指定時間（0-48小時）沒有因拉伸應(yīng)力而改變（圖3 A），整合素和β-連環(huán)蛋白特異性的條帶強度也顯著提高，且同樣在拉伸應(yīng)力后沒有減少（圖3 B-D）。此外，僅補充DAG或與拉伸應(yīng)力聯(lián)合應(yīng)用的EBs組在細(xì)胞質(zhì)和核酸部分均顯示出顯著高于對照組的β-連環(huán)蛋白水平（圖3 E-G）。

然后，為了探討β-連環(huán)蛋白介導(dǎo)的信號對DAG刺激的EBs成骨分化的作用，用si-對照或si-β-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)染。免疫印跡測定表明，si-β-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)染顯著降低了全蛋白裂解物中的β-連環(huán)蛋白水平。在培養(yǎng)14天后，與補充DAG或聯(lián)合si-對照轉(zhuǎn)染的EBs相比，si-β-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)染的EBs中的ARS強度略有降低的趨勢。然而，在si-β-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)染的EBs中，ARS染料的平均吸光度和ARS陽性菌落的數(shù)量與僅用DAG處理或與si-對照轉(zhuǎn)染一起處理時沒有顯著差異。這些數(shù)據(jù)表明，DAG刺激的EBs礦化及其受拉伸應(yīng)力的抑制不受β-連環(huán)蛋白介導(dǎo)的信號的直接影響。

圖3    拉伸應(yīng)力不會減弱 DAG 刺激的 EBs 中整合素和 β-連環(huán)蛋白的誘導(dǎo)。

為了評估ERK介導(dǎo)的信號對張力施加的EBs的影響，通過免疫印跡測定比較了對照組、DAG組和DAG/拉伸施加EB組之間的p-ERK水平（圖4 A）。與對照組或 DAG 組相比，拉伸應(yīng)力施加的 EBs 中發(fā)現(xiàn) p-ERK 迅速且持續(xù)性增加，然而，在拉伸應(yīng)力12 小時后，DAG刺激的ERK磷酸化被廣泛抑制。密度分析支持，DAG 處理的 EBs 中張力介導(dǎo)的 p-ERK 降低在 p-ERK1 而不是 p-ERK2 中進一步突出（圖4 B）。這些結(jié)果表明，DAG刺激的EBs中ERK1介導(dǎo)的信號與張力介導(dǎo)的成骨抑制作用密切相關(guān)。

圖4     拉伸應(yīng)力以時間依賴性方式抑制了ERK的磷酸化。

進一步地，用每種（10 μM）MAPK 抑制劑研究了 MAPKs 對 DAG 刺激的 EBs 礦化的影響。ARS染色結(jié)果表明，DAG誘導(dǎo)的EBs礦化被p-ERK的藥理抑制劑所抑制，非p-JNK或p-p38激酶的抑制劑。在MAPK處理的EB組中，與DAG對照EBs相比，僅在暴露于PD98059的EBs中發(fā)現(xiàn)ARS染料特異性吸光度顯著降低。用PD98059預(yù)處理也顯著抑制了EBs中DAG刺激的RUNX2，Osterix，BSP和OCN的表達。此外，在與藥理學(xué)ERK抑制劑聯(lián)合治療中，DAG介導(dǎo)的第5天EBs中RUNX2和Osterix蛋白的誘導(dǎo)顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明，藥理學(xué)ERK抑制劑通過下調(diào)成骨標(biāo)記基因表達來減弱DAG介導(dǎo)的EBs礦化。

最后，為了闡明ERK介導(dǎo)的信號在DAG刺激的EBs礦化中的作用，用si-ERK1、si-ERK2或兩者轉(zhuǎn)染。DAG誘導(dǎo)的EBs礦化通過si-ERK1而不是si-ERK2的轉(zhuǎn)染而減弱（圖5 A）。ARS染料特異性光密度的測量證實了ERK1介導(dǎo)的信號與DAG刺激的EBs礦化之間的關(guān)聯(lián)，因此與DAG對照組相比，si-ERK1轉(zhuǎn)染的EBs礦化顯著較低（圖5 B）。拉伸應(yīng)力介導(dǎo)的DAG刺激的EBs礦化減少與其直徑大小密切相關(guān)，其中si-ERK1或si-ERK1/2轉(zhuǎn)染的EBs的平均菌落直徑顯著小于DAG對照組（圖5 C）。用si-ERK1或si-ERK1/2轉(zhuǎn)染，而不用si-對照或si-ERK2轉(zhuǎn)染，顯著抑制了DAG處理的EBs中RUNX2和OCN的水平（圖5 D、E）。此外，ERK1 而不是 ERK2 介導(dǎo)的信號通過調(diào)節(jié) RUNX2 的表達介導(dǎo) DAG 刺激的 EBs 的礦化（圖5 F、G）。這些數(shù)據(jù)表明，ERK1介導(dǎo)的信號在DAG刺激的EBs中充當(dāng)RUNX2的上游效應(yīng)因子。

圖5     用 si-ERK1 轉(zhuǎn)染減少了 DAG 刺激的 EBs 礦化。（H）圖形概要

總之，該研究考察了循環(huán)拉伸應(yīng)力對 DAG 刺激的 EBs 成骨能力的影響及其相關(guān)機制（圖5 H）。研究表明，拉伸應(yīng)力抑制了 DAG 刺激的 EBs 成骨分化和礦化；還表明ERK1 介導(dǎo)的信號，而非 Wnt/β-catenin 信號，與張力介導(dǎo)的成骨抑制密切相關(guān)；p-ERK1 在 DAG 刺激的 EBs 中作為 RUNX2 的上游效應(yīng)子。

參考文獻：An JH, Kim CC, Lee J, Kim J, Lee JC, Kook SH. Tension Force Stress Downregulates the Expression of Osteogenic Markers and Mineralization in Embryonic Stem-Cell-Derived Embryoid Bodies. Cells. 2025 Jun 28;14(13):991. doi: 10.3390/cells14130991. PMID: 40643512; PMCID: PMC12248426.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40643512/

圖片來源：所有圖片均來源于參考文獻

小編旨在分享、學(xué)習(xí)、交流生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究進展。如有侵權(quán)或引文不當(dāng)請聯(lián)系小編修正。如有任何的想法以及建議，歡迎聯(lián)系小編。感謝各位的瀏覽以及關(guān)注！進入官網(wǎng)www.naturethink.com或關(guān)注“Naturethink”公眾號，了解更多相關(guān)內(nèi)容。

點擊了解：牽張應(yīng)變細(xì)胞培養(yǎng)儀