ISG15 調(diào)節(jié)骨髓源樹突狀細(xì)胞的炎癥特征和激活 CD8+ T 細(xì)胞的能力

ISG15 modulates inflammatory profiles and ability to activate CD8 + T cells in bone marrow-derived dendritic cells

Keywords: Dendritic cells; IL-1β; ISG15; Inflammasome.

干擾素刺激基因15（ISG15）是一種誘導(dǎo)型修飾蛋白，主要響應(yīng) I 型干擾素（IFNs）和病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）。ISG15可以與多種蛋白質(zhì)靶點(diǎn)相互作用或修飾，在病毒感染、細(xì)胞外囊泡（EVs）分泌、免疫調(diào)節(jié)、自噬或腫瘤發(fā)生等過程中以多種方式調(diào)節(jié)其功能。ISG15可由不同類型的細(xì)胞分泌，包括淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞，從而通過誘導(dǎo)IFN-γ分泌來調(diào)節(jié)NK細(xì)胞和T細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)。細(xì)胞外ISG15介導(dǎo)CD8+ T細(xì)胞的激活，對CD4+和CD8+ T細(xì)胞中IFN-γ分泌很重要。

關(guān)于先天免疫細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞（DCs）在對各種病原體進(jìn)行適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答中起著關(guān)鍵作用。除了抗原呈遞外，DCs還通過分泌多種細(xì)胞因子來激活不同的免疫細(xì)胞。在感染過程中，PAMPs被DCs中表達(dá)的Toll 樣受體（TLRs）識別。這些 PAMPs 可以激活不同的信號通路，如 NF-kB，從而導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子（如 IL-1β）的轉(zhuǎn)錄。在IL-1β分泌之前，proIL-1β必須被Caspase-1裂解。Caspase-1 需要由多蛋白復(fù)合物 NLRP3 炎性小體激活。NLRP3炎性小體與Caspase-1一起導(dǎo)致proIL-1β和proIL-18的切割，從而分泌這些促炎細(xì)胞因子。此外，TLR啟動后的ISG15誘導(dǎo)可能與NLRP3炎性小體的穩(wěn)定性和活性有關(guān)。

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一些研究的重點(diǎn)是破譯 ISG15 在調(diào)節(jié) T 細(xì)胞和 NK 細(xì)胞活化方面的功能，或揭示其在體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中的作用以及它如何在小鼠模型中誘導(dǎo)協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)。然而，ISG15調(diào)節(jié)Caspase-1或炎性小體活性的機(jī)制及其與DC功能特性的潛在聯(lián)系尚未得到詳細(xì)探索。

近日，西班牙馬德里自治大學(xué)醫(yī)學(xué)系及國家心血管研究中心（CNIC）團(tuán)隊(duì)的最新研究旨在闡明這種蛋白質(zhì)修飾劑在先天免疫細(xì)胞譜系中的功能作用。其結(jié)果表明，ISG15可以調(diào)節(jié)BMDCs的成熟和激活，ISG15 缺失會對它們介導(dǎo)CD8+ T細(xì)胞增殖和激活的能力產(chǎn)生負(fù)面影響，且ISG15 是 BMDCs 釋放促炎細(xì)胞因子（如 IL-1β 和 IL-12）所必需的。這些結(jié)果揭示了 ISG15 在 BMDCs 中的新功能。研究成果發(fā)表于 Cellular and Molecular Life Sciences 期刊題為“ISG15 modulates inflammatory profiles and ability to activate CD8 + T cells in bone marrow-derived dendritic cells”。

首先，在評估ISG15在BMDCs中的作用之前，生成了來自Isg15−/− 小鼠的BMDCs。IFN-α可誘導(dǎo)WT小鼠BMDCs中蛋白質(zhì)ISG化（ISGylation），但在ISG15-KO小鼠中未被誘導(dǎo)（圖1 A）。然后，通過不同TLR激動劑，從細(xì)胞外配體如 LPS（TLR4）、Pam3CSK4（TLR2/1）、Pam2CSK4（TLR2/6）到細(xì)胞內(nèi)配體如 pI: C（TLR3）、IMQ（TLR7/8）、CpG（TLR9），對ISG15在BMDCs上的誘導(dǎo)表達(dá)（和ISG化）進(jìn)行了詳細(xì)研究。與已報(bào)道的ISG15在抗病毒反應(yīng)中的功能一致，當(dāng)細(xì)胞受到基于DNA/RNA的TLR刺激時(shí)，觀察到Isg15 mRNA表達(dá)較高，同時(shí)在LPS刺激12小時(shí)和24小時(shí)后其表達(dá)水平也顯著升高（圖1 B）。一致地，在WT小鼠中也觀察到這些TLR激動劑處理后更高水平的蛋白質(zhì)ISG化以及細(xì)胞內(nèi)游離的ISG15，但在Isg15−/− 小鼠中沒有觀察到（圖1 C）。這些數(shù)據(jù)表明，在BMDCs中用IFN-α刺激后，細(xì)胞內(nèi)ISG15被誘導(dǎo)，并且與其他TLR激動劑相比，LPS可以誘導(dǎo)高水平的ISG15。

圖1    在小鼠BMDCs中用不同的PAMPs處理后誘導(dǎo)ISG15。

由于LPS誘導(dǎo)了zui高水平的ISG15，接下來，評估了ISG15-KO BMDC細(xì)胞響應(yīng)PAMP的激活和成熟狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)監(jiān)測了用LPS刺激的WT和KO小鼠的BMDC表面膜上活化標(biāo)志物CD40和CD86的水平，結(jié)果表明，ISG15-KO BMDCs在基線水平表達(dá)的CD40+ 細(xì)胞比例略高，但顯著高于對照組，表明其基礎(chǔ)活化狀態(tài)可能高于WT DCs（圖2 A）。盡管ISG15-KO BMDCs能夠在LPS刺激下增加CD40的表達(dá)，但與WT小鼠相比，觀察到KO細(xì)胞誘導(dǎo)CD40的能力顯著降低，這表明誘導(dǎo)細(xì)胞成熟的效果較差（圖2 A）。LPS處理后BMDCs表達(dá)CD86的百分比沒有觀察到差異，但CD86的誘導(dǎo)能力略有下降（圖2 A）。

在到達(dá)引流淋巴結(jié)（dLN）后，DC 的關(guān)鍵步驟是在免疫突觸（IS）通過與 T 細(xì)胞的親密接觸來呈遞抗原（Ag）。因此，研究人員試探索 ISG15 是否可能在 BMDC 介導(dǎo)的 T 細(xì)胞激活中發(fā)揮作用。為了解決這個(gè)問題，從 Isg15-WT 或 KO 小鼠中分化出 BMDCs，用卵清蛋白（OVA）注射，并與分別從 OVA Ag 特異性小鼠模型 OT-I 或 OT-II 中分離的初始 CD8+ T 細(xì)胞或初始 CD4+ T 細(xì)胞共培養(yǎng)（圖2 B）。有趣的是，Isg15缺失小鼠的BMDCs激活72小時(shí)后CD8+ T細(xì)胞的增殖顯著減少，但在CD4 +沒有（圖2 B）。此外，轉(zhuǎn)染ISG15-KO BMDCs的CD8+ T細(xì)胞的顆粒酶B表達(dá)低于轉(zhuǎn)染W(wǎng)T BMDCs的細(xì)胞（圖2 C），從而表明細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞的激活存在缺失。然而，IFN-γ + CD8 T細(xì)胞保持不變（圖2 C ）。因此，ISG15-KO BMDCs介導(dǎo)細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞增殖和激活的能力降低。

進(jìn)一步地，研究人員考慮了遷移在ISG15-KO BMDC中受到影響的可能性。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，進(jìn)行了Transwell測定在體外評估了ISG15-KO BMDCs在化學(xué)性誘導(dǎo)時(shí)響應(yīng)CCL21（一種在活化DC中高度表達(dá)的CCR7配體）的遷移能力。實(shí)驗(yàn)觀察到，KO BMDCs保留了響應(yīng)CCL21的遷移能力。這些結(jié)果表明，ISG15介導(dǎo)DCs的成熟，以及CD8 + T細(xì)胞的激活和增殖，但不介導(dǎo)DC遷移。

圖2    ISG15-KO BMDCs的激活、增殖和抗原呈遞能力。

最后，實(shí)驗(yàn)研究了 ISG15 在 BMDCs 用 LPS 刺激后 TLR 下游促炎細(xì)胞因子（如 IL-1β 和 IL-12）的表達(dá)和分泌中的作用。數(shù)據(jù)顯示，在用LPS處理12 h和24 h后，ISG15-KO BMDCs中Il-1β和Il-12 mRNA水平與WT相比沒有差異（圖3 A）。通過流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞內(nèi)染色評估了這些細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的水平，結(jié)果顯示，IL-1β 和 IL-12 在 LPS 處理后的 WT 和 KO 中表達(dá)相似，盡管在培養(yǎng) 24 小時(shí)后觀察到未處理的 ISG15-KO BMDCs 中 IL-1β+ 細(xì)胞的比例略有下降（圖3 B）。有趣的是，在測量了 BMDC 培養(yǎng)物中分泌的 IL-1β 和 IL-12 的細(xì)胞外水平后，觀察到 LPS 處理 12 小時(shí)和 24 小時(shí)后 ISG15-KO BMDC 上清液中這些細(xì)胞因子明顯減少（圖3 C）。此外，在LPS刺激下，ISG15-KO BMDCs分泌的 IL-1β 比IL-12 減少得多（圖3 D）。

為了排除 NF-кB 通路或 NLRP3 炎性小體的缺失，還測定了 p65 磷酸化水平和 NLRP3 總水平。然而，在 LPS 刺激下 KO 與 WT BMDCs 中沒有觀察到這些蛋白質(zhì)顯著降低（圖3 E）。因此，隨后探索了 ISG15 KO 細(xì)胞可能存在 IL-1β 切割和成熟缺失的可能性。實(shí)驗(yàn)評估了 ISG15-KO BMDCs 中 Caspase-1 的水平，結(jié)果顯示了 Procaspase-1 水平降低的趨勢（圖3 F）。這種減少似乎不是增強(qiáng)裂解成其活性形式的結(jié)果，而是 Procaspase 本身水平降低的結(jié)果。此外，Procaspase-1 水平與可溶性IL-1β水平呈正相關(guān)（圖3 G），進(jìn)一步支持Procaspase-1  的表達(dá)是有效分泌 IL-1β 所必須的。

基于先前的觀察，研究人員想知道游離細(xì)胞外重組 ISG15 （rISG15）在調(diào)節(jié) IL-1β 分泌水平中的作用可能是什么。通過將 rISG15 和 IL-12 添加到細(xì)胞培養(yǎng)物并經(jīng) LPS 處理 12 小時(shí)和 24 小時(shí)后，評估Isg15 缺失 BMDCs 中 mRNA Il-1β 和細(xì)胞外 IL-1β 的水平。數(shù)據(jù)顯示，在 rISG15 處理后，Il-1β 的 mRNA 水平增加。然而，在KO BMDCs中添加rISG15，IL-1β的細(xì)胞外水平保持不變（圖3 H）。通過添加多克隆抗-ISG15抗體阻斷游離細(xì)胞外ISG15并沒有顯著改變WT BMDCs的IL-1β分泌量（圖3 I）。這些結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)ISG15調(diào)節(jié) Procaspase-1的表達(dá)，這是LPS刺激后有效激活I(lǐng)L-1β所必需的。

圖3    IL-1β 和 IL-12 在 ISG15-KO BMDCs 中的表達(dá)以及炎癥小體活性。

總體而言，這項(xiàng)研究提供了 ISG15 在 DC 激活、促炎細(xì)胞因子分泌以及促進(jìn) CD8 + T 細(xì)胞擴(kuò)增和激活中的關(guān)鍵功能的證據(jù)。結(jié)果表明，盡管激活標(biāo)志物 CD40 的誘導(dǎo)顯著減少，但 Isg15−/− BMDCs 的激活并未受到嚴(yán)重阻礙。盡管未來需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證實(shí) ISG15 和 Caspase-1 之間的相互作用，但該研究已經(jīng)表征了 ISG15 在 BMDCs 分泌 IL-1β 和 IL-12 中的作用。因此，ISG15 調(diào)節(jié)關(guān)鍵炎癥分子和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的能力使其成為開發(fā)基于 DC 的新型免疫調(diào)節(jié)療法的有前途的靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Martínez-Fleta P, Pertusa C, Fernández-Delgado I, Izquierdo-Serrano R, Ramírez-Huesca M, Fernández-Gallego N, Calzada-Fraile D, Moya-Ruiz E, Castillo-González R, Guerra S, Martín-Gayo E, Sánchez-Madrid F. ISG15 modulates inflammatory profiles and ability to activate CD8 + T cells in bone marrow-derived dendritic cells. Cell Mol Life Sci. 2025 Oct 24;82(1):362. doi: 10.1007/s00018-025-05849-9. PMID: 41134371.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41134371/

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