機(jī)械刺激馬源骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞體外軟骨模型可觸發(fā)骨關(guān)節(jié)炎特征

Mechanical Stimulation of Equine Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cell-Derived Cartilage-Like In Vitro Model Triggers Osteoarthritis Features

Keywords: chondrocytes; equine cartilage; in vitro model; mechanical compression; mesenchymal stromal cells; osteoarthritis.

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種影響世界數(shù)百萬人的普遍疾病，尤其是對人類和馬匹的影響。這種衰弱性疾病的特征是不可逆的軟骨退化、慢性炎癥和關(guān)節(jié)功能的下降，由機(jī)械和生化因素驅(qū)動(dòng)。機(jī)械負(fù)荷在軟骨細(xì)胞調(diào)節(jié)的軟骨穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用，并已被證明可以影響細(xì)胞行為。然而，損傷性負(fù)荷會(huì)對軟骨產(chǎn)生不利影響。體外研究表明，過度壓縮負(fù)荷與細(xì)胞死亡增加（包括細(xì)胞壞死和凋亡）、蛋白聚糖的釋放，以及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的退化有關(guān)。

點(diǎn)擊了解：仿生壓力細(xì)胞培養(yǎng)儀

軟骨細(xì)胞是軟骨中的主要細(xì)胞類型，主要通過整合素-基質(zhì)相互作用、機(jī)械敏感離子通道的激活（如瞬時(shí)受體電位香草素（TRPV）通道或 Piezo-通道）以及初級(jí)纖毛誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)感知和響應(yīng)機(jī)械負(fù)荷。間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（MSCs）也可以感知機(jī)械刺激（MS），特別是通過 TRPV4，這會(huì)影響 ECM 穩(wěn)態(tài)和組成。

動(dòng)物模型，包括小型和大型動(dòng)物的自發(fā)性和誘導(dǎo)性 OA，對于評(píng)估 OA 新興治療方法的治療潛力至關(guān)重要。大型動(dòng)物模型，如馬，在解剖結(jié)構(gòu)上與人類相似，對于研究 OA 進(jìn)展和改進(jìn)治療特別有價(jià)值�；�于此，法國卡昂諾曼底大學(xué)聯(lián)合研究實(shí)驗(yàn)室BIOTARGEN UR7450團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究利用馬骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（BM-MSC）構(gòu)建體外OA模型，對 MSC 衍生的軟骨細(xì)胞施加壓縮力，并評(píng)估細(xì)胞感知 MS 的能力以及 MS 對細(xì)胞活力、ECM 組成和關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)志物表達(dá)的影響。研究成果發(fā)表于 ACS Biomaterials Science & Engineering 期刊題為“Mechanical Stimulation of Equine Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cell-Derived Cartilage-Like In Vitro Model Triggers Osteoarthritis Features”。

首先，研究人員通過將馬 BM-MSCs 接種在膠原蛋白海綿并在軟骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)構(gòu)建了軟骨樣體外模型（圖1 A）。然后比較了MSCs、MSCs衍生的軟骨細(xì)胞和馬關(guān)節(jié)軟骨分離的軟骨細(xì)胞中TRPV4的轉(zhuǎn)錄水平。有趣的是，MSCs向軟骨細(xì)胞的分化誘導(dǎo) TRPV4 水平增加 100 倍（圖1 B）。為了確認(rèn)MSCs來源的軟骨細(xì)胞可以感知機(jī)械刺激（MS），軟骨樣體外模型在靜態(tài)條件下或以 2.5 kPa、0.2Hz的壓縮幅度進(jìn)行 MS 15 分鐘（圖1 A）。正如預(yù)期，實(shí)驗(yàn)觀察到 MS 下，P44/42 MAPK 的磷酸化比靜態(tài)條件下增加（圖1 C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，MSC 衍生的軟骨細(xì)胞表達(dá)機(jī)械敏感離子 TRPV4 通道，并且可以將 MS 整合到細(xì)胞內(nèi)信號(hào)中。

圖1    馬 BM-MSC 衍生的軟骨細(xì)胞表達(dá) TRPV4 并感知機(jī)械刺激。

下一步是研究壓縮是否影響細(xì)胞活力。為此，將馬骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞衍生的軟骨細(xì)胞用EdU（一種胸腺嘧啶類似物，檢測細(xì)胞增殖情況）孵育。令人驚訝的是，與靜態(tài)條件相比，MS（D24）下3天后EdU 陽性細(xì)胞的數(shù)量減少（圖2 A、B）。與對照組相比，增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）蛋白含量明顯降低（圖2 C）。因此，MS后3天和7天，細(xì)胞核數(shù)/mm2 略有下降（圖2 F）。同時(shí)，進(jìn)行了 TUNEL 測定評(píng)估對細(xì)胞凋亡的影響。無論在對照條件下還是在MS下，凋亡核的比例都很低，持續(xù)3天（D24）或7天（D28）（圖2 D、E）。此外，通過損傷細(xì)胞向培養(yǎng)基中釋放腺苷酸激酶來測量，無論持續(xù)時(shí)間如何，MS都不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。這些發(fā)現(xiàn)表明，MS 對馬MSC來源的軟骨細(xì)胞可減少細(xì)胞增殖，而不影響細(xì)胞死亡或凋亡。

圖2   機(jī)械刺激減少馬 BM-MSC 衍生的軟骨細(xì)胞增殖。

接下來，實(shí)驗(yàn)試圖確定 MS 是否與在軟骨樣體外模型中誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎特征相關(guān)。在施加MS后，研究了編碼ECM成分和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的基因的mRNA水平以及ECM的質(zhì)量。在靜態(tài)條件下培養(yǎng)的軟骨樣體外模型在D21和D24/D28天之間的ACAN、COL2A1、SOX9、PRG4、COL1A1和RUNX2 mRNA  水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，COL2A1/COL1A1 比值沒有變化，但COMP的mRNA水平在D24時(shí)降低。相反，經(jīng)歷MS后，與D21相比，COL2A1、SOX9、PRG4和RUNX2 mRNA水平升高，COL1A1保持不變，COL2A1/COL1A1比值升高，COMP 水平相似。

為了研究軟骨樣體外模型中ECM的質(zhì)量，使用Western blot 分析評(píng)估了膠原蛋白的水平，在加壓 3 天后（D24），與靜態(tài)條件下相比，MS 條件下 I 型膠原蛋白和 IIB 型膠原蛋白的含量較低，7天后（D28）I型和IIB型膠原蛋白的數(shù)量急劇減少（圖3 A）。因此，軟骨樣體外模型的MS導(dǎo)致部分ECM成分的mRNA水平增加，但未在蛋白水平上反映出來。

同時(shí)進(jìn)行了組織學(xué)分析，使用不同的染色方法可視化ECM。在 21 天時(shí)，軟骨樣體外模型充滿新合成的 ECM，并在海綿中均勻分布（圖3 B）。事實(shí)上，與中心相比，在外圍觀察到更高的染色強(qiáng)度。無論培養(yǎng)條件如何，軟骨樣體外模型都沒有表現(xiàn)出明顯的骨化跡象，因?yàn)檐缢丶t染色仍然很弱。MS 3 天后（D24），與靜態(tài)條件相比，GAG（糖胺聚糖）和膠原蛋白含量減少。加壓 7 天后（D28），ECM 含量的減少變得更加明顯，特別是 II 型膠原蛋白（圖3 B、C）。

這些發(fā)現(xiàn)表明，MS 通過減少軟骨樣體外模型中的 GAG 和膠原蛋白量來損害 ECM 的質(zhì)量，而不會(huì)降低主要 ECM 成分的 mRNA 水平。

圖3    機(jī)械刺激會(huì)損害 ECM 成分的積累。

最后，實(shí)驗(yàn)研究了分解代謝的增加是否會(huì)引發(fā)MS時(shí) ECM 的改變。促炎細(xì)胞因子在誘導(dǎo)分解代謝過程中起著重要作用。在測試的 23 種細(xì)胞因子中，只有 3 種達(dá)到檢測閾值。靜態(tài)條件下，成纖維細(xì)胞生長因子2（FGF-2）、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）水平均低于檢測閾值。然而，在機(jī)械壓縮下，這三種細(xì)胞因子的濃度顯著增加，表明MS誘導(dǎo)FGF-2，G-CSF和GM-CSF的釋放或表達(dá)增加。

在OA期間參與蛋白聚糖降解的主要聚集酶ADAMTS5的mRNA水平在MS 3天后增加了約50倍（D24），并且這種趨勢在7天后持續(xù)（D28）（圖4 A）。此外，還研究了 HtrA1，一種已知在 OA 中發(fā)揮多種作用的絲氨酸蛋白酶，向減少和受損的ECM聚集。評(píng)估顯示，MS 3 天后HtrA1 蛋白水平升高，并持續(xù)到7天后（圖4 B）。同樣，MS 3 天后 MMP 活性升高（圖4 C），說明基質(zhì)酶參與觀察到的反應(yīng)。

鑒于軟骨樣體外模型ECM 的蛋白聚糖/GAG含量較高，其降解可能導(dǎo)致其釋放到培養(yǎng)基中，因此測量了培養(yǎng)基中GAG的水平。在靜態(tài)條件下（從第24天到第28天）GAG濃度似乎隨著時(shí)間的推移而增加。一個(gè)周期的MS（D21）不影響培養(yǎng)基中的GAG濃度（圖4 D）。相反，MS 在 3 天（D24）和 7 天（D28）后誘導(dǎo) GAG 和 COMP 濃度升高（圖4 D、E）。一氧化氮（NO）是 OA 中的關(guān)鍵炎癥介質(zhì)。由于NO在溶液中不穩(wěn)定，會(huì)迅速轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，因此測定了培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的濃度，發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽濃度在加壓 3 天和 7 天后顯著增加（圖4 F）。

這些發(fā)現(xiàn)表明，MS 可以增加馬 BM-MSC 衍生軟骨細(xì)胞的炎癥介質(zhì)并促進(jìn)分解代謝，從而促進(jìn) ECM 降解。

圖4    馬 BM-MSC 衍生軟骨細(xì)胞的機(jī)械刺激促進(jìn)分解代謝相關(guān)事件。

圖5    圖形概要

總之，這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了機(jī)械刺激與軟骨代謝之間的復(fù)雜關(guān)系，表明機(jī)械應(yīng)力可以在源自 BM-MSCs 的軟骨樣體外模型中誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎特征，如炎癥介質(zhì)、ECM 下調(diào)和蛋白酶上調(diào)。此外，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了軟骨模型中控制機(jī)械負(fù)荷的重要性，因?yàn)檫^度壓縮可以模擬 OA 等關(guān)節(jié)疾病中出現(xiàn)的退行性變化。許多機(jī)械傳感器位于細(xì)胞表面，包括初級(jí)纖毛、各種離子通道（如 TRPV4 和 PIEZO）以及整合素，將機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，這取決于機(jī)械刺激的大小，并且可以被周圍的微環(huán)境調(diào)節(jié)。此外，機(jī)械刺激可以直接或間接促進(jìn)修飾ECM的蛋白酶的上調(diào)，從而釋放各種影響細(xì)胞行為的因子。因此，未來需要進(jìn)一步的研究來充分闡明將機(jī)械刺激與軟骨樣模型中的骨關(guān)節(jié)炎特征聯(lián)系起來的機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：Contentin R, Jehl C, Commenchail K, Legendre F, Galéra P, Cassé F, Demoor M. Mechanical Stimulation of Equine Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cell-Derived Cartilage-Like In Vitro Model Triggers Osteoarthritis Features. ACS Biomater Sci Eng. 2025 Jul 14;11(7):4153-4165. doi: 10.1021/acsbiomaterials.5c00500. Epub 2025 Jun 13. PMID: 40512481; PMCID: PMC12264857.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40512481/

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