表達(dá)早老蛋白的內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)法適應(yīng)剪切應(yīng)力

Progerin-expressing endothelial cells are unable to adapt to shear stress

Keywords: HGPS; ECs; fluid shear stress; lamin A; ZMPSTE24; cell loss; nuclear abnormalities; lonafarnib; methylstat.

核纖層作為核膜內(nèi)膜與染色質(zhì)間的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)，具有支持細(xì)胞核結(jié)構(gòu)、影響核形態(tài)、基因調(diào)控及細(xì)胞分裂時(shí)核組裝解體等作用，且在力作用下有機(jī)械適應(yīng)和響應(yīng)特性。早老癥（HGPS）由 LMNA 基因的常染色體顯性突變引發(fā)，該突變導(dǎo)致異常早老蛋白產(chǎn)生，其因缺失特定切割位點(diǎn)而yongjiu法尼基化，這是該病關(guān)鍵特征，ZMPSTE24 敲除小鼠的表現(xiàn)可佐證。早老蛋白在核周積累，會(huì)改變核纖層結(jié)構(gòu)，引發(fā)核形態(tài)異常、硬度增加、異染色質(zhì)重分布等一系列核缺陷。

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HGPS 患者會(huì)因加速性動(dòng)脈粥樣硬化引發(fā)心臟病、中風(fēng)等導(dǎo)致早逝，其心血管異常與衰老個(gè)體的動(dòng)脈粥樣硬化表現(xiàn)相似，但不存在傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素。目前關(guān)鍵問題是早老蛋白如何影響血管系統(tǒng)引發(fā)快速動(dòng)脈粥樣硬化。研究發(fā)現(xiàn)，該病特征之一是大動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞丟失，而血管平滑肌細(xì)胞中早老蛋白的表達(dá)會(huì)損害細(xì)胞增殖、削弱對(duì)生理牽張力的響應(yīng)、降低血管反應(yīng)性，并通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激加速動(dòng)脈粥樣硬化。早老蛋白還會(huì)影響內(nèi)皮細(xì)胞功能，相關(guān)小鼠模型顯示其會(huì)引發(fā)炎癥、血管形成受損、心臟病變等，且內(nèi)皮細(xì)胞機(jī)械響應(yīng)能力受損。

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基于此，弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系的研究團(tuán)隊(duì)通過建立早老癥細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，表達(dá)早老蛋白或 ZMPSTE24 敲低的內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)法適應(yīng)生理水平流體剪切應(yīng)力，會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞丟失，而特定抑制劑處理或預(yù)先讓細(xì)胞適應(yīng)剪切應(yīng)力可緩解這一情況。這表明內(nèi)皮細(xì)胞因早老蛋白表達(dá)而無(wú)法適應(yīng)流體剪切應(yīng)力的機(jī)械力，可能是早老癥患者動(dòng)脈粥樣硬化快速發(fā)生的重要原因。研究成果發(fā)表在Biomedical Journal期刊，題為“Progerin-expressing endothelial cells are unable to adapt to shear stress”。

首先，研究人員探討了早老蛋白表達(dá)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞響應(yīng)流體剪切應(yīng)力的影響，發(fā)現(xiàn)表達(dá)早老蛋白或過表達(dá)野生型核纖層蛋白 A 的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，在12 dynes/cm² 剪切應(yīng)力作用 72 小時(shí)后細(xì)胞數(shù)量顯著減少（圖 1A 和 B），蛋白質(zhì)印跡法用于證實(shí)核纖層蛋白 A 和早老蛋白的過表達(dá)（圖 1C），而 24 小時(shí)時(shí)細(xì)胞損失極小，且靜態(tài)培養(yǎng)中無(wú)細(xì)胞損失，說明細(xì)胞損失并非快速發(fā)生，且依賴于流體剪切應(yīng)力。同時(shí)，表達(dá)早老蛋白的細(xì)胞在剪切應(yīng)力作用 24 小時(shí)后出現(xiàn)大量磷脂酰絲氨酸表面表達(dá)（圖 1D），這表明凋亡先于細(xì)胞損失發(fā)生。

圖1   早老蛋白的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致 HUVECs 在層流剪切應(yīng)力下發(fā)生細(xì)胞損失。

接著，研究人員通過 shRNA 敲低人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中 ZMPSTE24 構(gòu)建早老癥模型，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞 ZMPSTE24 含量減少 40%（圖 1G），出現(xiàn)核褶皺增多及剪切應(yīng)力下細(xì)胞損失等類似早老癥的特征（圖 1E 和 F）。此外，將表達(dá)早老蛋白的細(xì)胞置于層流和振蕩剪切應(yīng)力中，未發(fā)現(xiàn)不同流型導(dǎo)致細(xì)胞損失有顯著差異（圖 1H 和 I）。這些結(jié)果表明，核纖層蛋白 A 過表達(dá)或早老蛋白表達(dá)會(huì)影響內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)流體流動(dòng)作用力的適應(yīng)能力。

接下來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)，表達(dá)早老蛋白的內(nèi)皮細(xì)胞在流動(dòng)和靜態(tài)條件下均存在核形態(tài)異常，這與早老癥細(xì)胞核纖層機(jī)械應(yīng)力下重排能力降低相關(guān)。通過量化分析，表達(dá)早老蛋白的內(nèi)皮細(xì)胞存在核纖層畸形（圖2A）、核向外囊泡（圖 2B）、微核（圖 2C）等核異常，且核纖層蛋白 B 結(jié)構(gòu)被破壞，同時(shí)這些核異常在剪切應(yīng)力（圖 2D）和靜態(tài)條件（圖 2E）下的發(fā)生水平相近，與非內(nèi)皮細(xì)胞類型中的早老癥相關(guān)觀察結(jié)果一致。

圖2    層流剪切應(yīng)力會(huì)導(dǎo)致表達(dá)早老蛋白的 HUVECs 出現(xiàn)核膜破壞。

表達(dá)早老蛋白的細(xì)胞因法尼基附著導(dǎo)致核膜葉狀化，而洛那法尼作為法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，可阻止早老蛋白積累并改善核形態(tài)。研究人員用洛那法尼處理 ZMPSTE24 敲低細(xì)胞和表達(dá)早老蛋白的內(nèi)皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，其能顯著減少 ZMPSTE24 敲低細(xì)胞在剪切應(yīng)力下的損失（圖 3A 和 B），但對(duì)表達(dá)早老蛋白的細(xì)胞損失無(wú)顯著改善。此外，其還可防止表達(dá)早老蛋白的細(xì)胞出現(xiàn)核膜破壞（圖 3C 和 D）。這表明洛那法尼能增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)機(jī)械力變化的響應(yīng)和適應(yīng)能力。

圖3   洛那法尼可逆轉(zhuǎn)剪切應(yīng)力下表達(dá)早老蛋白的 HUVECs 的細(xì)胞損失和核膜破壞。

表達(dá)早老蛋白的細(xì)胞存在組蛋白修飾異常，而藥物誘導(dǎo)異染色質(zhì)增加可改善其核形態(tài)。研究人員用組蛋白三甲基去甲基化酶抑制劑甲基化抑制劑（methylstat）處理 ZMPSTE24 敲低及表達(dá)早老蛋白的內(nèi)皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，在剪切應(yīng)力作用下，這些細(xì)胞的損失（圖 4A 和 B）和核膜破壞均被阻止（圖 4C 和 D）。這表明，增加表達(dá)早老蛋白的內(nèi)皮細(xì)胞的 DNA 甲基化水平，可逆轉(zhuǎn)其核形態(tài)并恢復(fù)對(duì)剪切應(yīng)力的適應(yīng)能力。

 圖4  甲基化抑制劑可逆轉(zhuǎn)剪切應(yīng)力下表達(dá)早老蛋白的HUVECs 及 ZMPSTE24 敲低細(xì)胞的細(xì)胞損失。

最后，研究人員推測(cè)，無(wú)需經(jīng)歷細(xì)胞和核形態(tài)變化的表達(dá)早老蛋白的內(nèi)皮細(xì)胞受剪切應(yīng)力影響更小。為了探究早老蛋白的表達(dá)會(huì)如何影響已排列的內(nèi)皮細(xì)胞，研究人員通過將未轉(zhuǎn)導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞暴露于剪切應(yīng)力中 72 小時(shí)以誘導(dǎo)其排列 ，再轉(zhuǎn)導(dǎo)早老蛋白并繼續(xù)暴露于剪切應(yīng)力72 小時(shí)。結(jié)果顯示，與未適應(yīng)剪切應(yīng)力的表達(dá)早老蛋白的細(xì)胞（圖 5B）相比，預(yù)先排列的細(xì)胞中表達(dá)早老蛋白（圖 5A）可減少細(xì)胞損失（圖 5C）并減少核膜破壞（圖 5D）。這些結(jié)果表明，表達(dá)早老蛋白的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)先排列可防止剪切應(yīng)力下的細(xì)胞損失。

 圖5   表達(dá)早老蛋白的HUVECs 預(yù)先排列可防止剪切應(yīng)力下的細(xì)胞損失。

總之，該研究表明，核纖層的變化（如早老蛋白表達(dá)、核纖層蛋白 A 過表達(dá)或 ZMPSTE24 缺失）會(huì)影響內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)流體剪切應(yīng)力的正常適應(yīng)能力，這可能是早老癥患者動(dòng)脈粥樣硬化快速發(fā)生的重要原因，同時(shí)也凸顯了核纖層在內(nèi)皮細(xì)胞機(jī)械適應(yīng)中的關(guān)鍵作用。

參考文獻(xiàn)：Danielsson BE, Peters HC, Bathula K, Spear LM, Noll NA, Dahl KN, Conway DE. Progerin-expressing endothelial cells are unable to adapt to shear stress. Biophys J. 2022 Feb 15;121(4):620-628. doi: 10.1016/j.bpj.2022.01.004. Epub 2022 Jan 6. PMID: 34999130; PMCID: PMC8873939.
原文鏈接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC8873939/

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