機(jī)械應(yīng)力經(jīng)激活BDKRB1-ERK軸促進(jìn)鈣內(nèi)流和肺泡上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)

Mechanical stress facilitates calcium influx and growth of alveolar epithelial cells via activation of the BDKRB1/Ca2+/CaMKII/MEK1/ERK axis

Keywords: Alveolar epithelial cells, Mechanical stress, Calcium, Growth, Bradykinin receptor B1

肺部在呼吸過程中持續(xù)承受機(jī)械力，這種機(jī)械應(yīng)力通過細(xì)胞外基質(zhì)影響細(xì)胞 - 基質(zhì)相互作用，對(duì)肺組織細(xì)胞功能及機(jī)械穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)至關(guān)重要。但非生理性機(jī)械負(fù)荷可引發(fā)多種肺部疾病，而多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路參與這些過程中的生理穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，因此闡明機(jī)械應(yīng)力相關(guān)分子機(jī)制對(duì)改善肺功能和促進(jìn)肺組織網(wǎng)絡(luò)重塑意義重大。

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BDKRB1 作為 G 蛋白偶聯(lián)受體，參與多種生理病理過程，其表達(dá)變化與肺發(fā)育及肺部疾病相關(guān)，且能調(diào)節(jié)鈣代謝。鑒于鈣代謝在機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的肺組織網(wǎng)絡(luò)重塑中的重要性，推測(cè)機(jī)械應(yīng)力可能通過 BDKRB1 介導(dǎo)的信號(hào)通路在肺發(fā)育過程中調(diào)控鈣代謝。

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基于此，昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科的研究團(tuán)隊(duì)通過對(duì)肺泡上皮細(xì)胞施加機(jī)械應(yīng)力來研究該應(yīng)力對(duì) BDKRB1 表達(dá)的影響，并闡明機(jī)械應(yīng)力與 BDKRB1 在調(diào)節(jié)鈣代謝中的作用。研究成果發(fā)表在 Respiratory Research  期刊，題為“Mechanical stress facilitates calcium influx and growth of alveolar epithelial cells via activation of the BDKRB1/Ca2+/CaMKII/MEK1/ERK axis”。

首先，研究人員通過 CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)、EdU 染色等實(shí)驗(yàn)，分析不同振幅（5%、10%、15%）機(jī)械應(yīng)力對(duì)肺泡上皮細(xì)胞（ RLE-6TN ）生長(zhǎng)及鈣穩(wěn)態(tài)的影響。

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，施加 5% 機(jī)械應(yīng)力 6、12、24 小時(shí)后，RLE-6TN 細(xì)胞活力未受顯著影響（圖 1A，P>0.05）；而 10% 機(jī)械應(yīng)力處理 12、24 小時(shí)可顯著提高細(xì)胞活力，15% 振幅的機(jī)械應(yīng)力則會(huì)顯著降低細(xì)胞活力（圖 1A，P<0.05）。 rle-6tn="" g2="" p="">0.05）；且 5% 振幅處理 6、12、24 小時(shí)后，細(xì)胞在 G1 期、S 期、G2 期的分布未發(fā)生顯著改變（圖 1B，P>0.05）。但 10% 振幅處理 6、12 小時(shí)會(huì)使 G1 期細(xì)胞比例降低、S 期細(xì)胞比例升高（圖 1B，P<0.05）；相反，15% 振幅處理 12、24 小時(shí)會(huì)導(dǎo)致 G1 期細(xì)胞比例升高、S 期細(xì)胞比例降低（圖 1B，P<0.05）。

圖1   機(jī)械應(yīng)力對(duì) RLE-6TN 細(xì)胞活力及細(xì)胞周期的影響 。

接著，研究人員通過 EdU 染色評(píng)估機(jī)械應(yīng)力對(duì)細(xì)胞增殖的影響發(fā)現(xiàn)，10% 機(jī)械應(yīng)力在所有時(shí)間點(diǎn)均能顯著提高 EdU 陽性率，15% 機(jī)械應(yīng)力則會(huì)顯著降低該陽性率（圖 2，P<0.05）。這些結(jié)果提示，10% 機(jī)械應(yīng)力可促進(jìn) RLE-6TN 細(xì)胞生長(zhǎng)，15% 機(jī)械應(yīng)力則抑制細(xì)胞增殖。

圖 2    機(jī)械應(yīng)力對(duì) RLE-6TN 細(xì)胞增殖的影響。

在鈣內(nèi)流方面，任何振幅的機(jī)械應(yīng)力處理 6 小時(shí)，均未顯著改變 Fluo-3 + 細(xì)胞比例（圖 3，P>0.05）；而處理 12、24 小時(shí)后，F(xiàn)luo-3 + 細(xì)胞比例顯著升高（圖 3，P<0.05），表明機(jī)械應(yīng)力可增強(qiáng)細(xì)胞的鈣內(nèi)流。

圖 3 機(jī)械應(yīng)力對(duì) RLE-6TN 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

已證實(shí) BDKRB1 與 CaMKIIα/δ 均與鈣代謝相關(guān)。因此，研究人員進(jìn)一步探究了不同振幅的機(jī)械應(yīng)力對(duì)肺泡上皮細(xì)胞中 BDKRB1 與 CaMKIIα/δ 表達(dá)的影響。 RT-qPCR 分析顯示 ，10% 和 15% 機(jī)械應(yīng)力可上調(diào) BDKRB1 與 CaMKIIα/δ 的 mRNA 表達(dá)（圖 4A，P<0.05），5% p="">0.05 ）。這些結(jié)果提示，機(jī)械應(yīng)力可能通過上調(diào) BDKRB1 與 CaMKIIα/δ 的表達(dá)，誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生鈣內(nèi)流。

 圖4 機(jī)械應(yīng)力對(duì)RLE-6TN細(xì)胞中BDKRB1/Ca²⁺/CaMKII/MEK1/ERK軸的影響。

已知鈣代謝可調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)，且該過程與 MEK1/ERK 通路相關(guān) 。因此，研究人員進(jìn)一步觀察了 RLE-6TN 細(xì)胞中 MEK1/ERK 通路的活性變化。結(jié)果顯示，15% 機(jī)械應(yīng)力處理 12、24 小時(shí)后，MEK1、ERK1 與 ERK2 的 mRNA 水平顯著降低（圖4B，P<0.05），而其他振幅的機(jī)械應(yīng)力對(duì)此無顯著影響（圖 p="">0.05）。在蛋白水平，10% 機(jī)械應(yīng)力處理 12 小時(shí)（既促生長(zhǎng)又促鈣內(nèi)流的條件）可上調(diào)軸中關(guān)鍵分子（BDKRB1、CaMKIIα/δ）及通路磷酸化蛋白（p-MEK1、p-ERK1/2）的表達(dá)（圖 4C、D，P<0.05） 。這些結(jié)果表明，10% 機(jī)械應(yīng)力可激活 BDKRB1/Ca²⁺/CaMKII/MEK1/ERK 軸，這可能是其促進(jìn) RLE-6TN 細(xì)胞生長(zhǎng)與鈣內(nèi)流的重要機(jī)制。

接下來，為了驗(yàn)證 10% 機(jī)械應(yīng)力的作用是否通過 BDKRB1/Ca²⁺/CaMKII/MEK1/ERK 軸介導(dǎo)，研究人員采用慢病毒介導(dǎo)的 RNA 干擾技術(shù)敲低 RLE-6TN 細(xì)胞中 BDKRB1 的表達(dá)。先篩選出敲低效率最高的 Lv-BDKRB1 #3 載體，使 BDKRB1 的 mRNA 水平降低（圖 5A）。對(duì)比各組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10% 機(jī)械應(yīng)力能顯著促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)指標(biāo)（活力、S 期比例、EdU 陽性率）和鈣內(nèi)流，而陰性對(duì)照無影響（圖 5B-E）。但 BDKRB1 敲低后，上述受 10% 機(jī)械應(yīng)力促進(jìn)的指標(biāo)均顯著下降，G1 期細(xì)胞比例升高（圖 5B-E）。這些結(jié)果表明， BDKRB1 是 10% 機(jī)械應(yīng)力發(fā)揮促生長(zhǎng)、促鈣內(nèi)流作用的關(guān)鍵介導(dǎo)分子。  

圖 5    BDKRB1 敲低對(duì)機(jī)械應(yīng)力介導(dǎo)的 RLE-6TN 細(xì)胞生長(zhǎng)及鈣內(nèi)流的影響。

最后，研究人員進(jìn)一步探究了抑制 BDKRB1 對(duì) 10% 機(jī)械應(yīng)力介導(dǎo)的 BDKRB1/Ca²⁺/CaMKII/MEK1/ERK 軸的影響。結(jié)果顯示，10% 機(jī)械應(yīng)力可顯著提高 RLE-6TN 細(xì)胞中 BDKRB1、CaMKIIα/δ、p-MEK1及 p-ERK1/2 的水平，但不影響 MEK1 和 ERK1/2 的 mRNA 或蛋白表達(dá)（圖 6A-D，P>0.05），陰性對(duì)照無顯著影響（圖 6A-D，P>0.05）。而BDKRB1 敲低能顯著降低 BDKRB1、CaMKIIα/δ 的 mRNA （圖 6A）和蛋白水平（圖 6C ），以及 p-MEK1、p-ERK1/2 的水平，但對(duì)總 MEK1 和 ERK1/2 的表達(dá)無顯著影響（圖 6B、6D，P > 0.05）。這些結(jié)果表明，BDKRB1 抑制可削弱 10% 機(jī)械應(yīng)力對(duì) RLE-6TN 細(xì)胞中 Ca²⁺/CaMKII/MEK1/ERK 軸的刺激作用。

圖 6 BDKRB1 敲低對(duì)機(jī)械應(yīng)力介導(dǎo)的 RLE-6TN 細(xì)胞中 Ca²⁺/CaMKII/MEK1/ERK 軸的影響。

圖7   機(jī)械應(yīng)力相關(guān)信號(hào)機(jī)制。

總之，該研究表明， 10% 幅度的機(jī)械應(yīng)力可通過上調(diào) BDKRB1 表達(dá)促進(jìn)鈣內(nèi)流，進(jìn)而激活 CaMKII/MEK1/ERK 信號(hào)通路，最終促進(jìn) RLE-6TN 細(xì)胞生長(zhǎng)（圖 7）。該研究揭示了鈣代謝相關(guān)的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為理解和治療機(jī)械應(yīng)力相關(guān)肺部疾病提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：Zhang Y, Zhang QD, Li Q, Shi ZY, Pan C, Yan RS, Fei DR, Xu SX, Luo Y. Mechanical stress facilitates calcium influx and growth of alveolar epithelial cells via activation of the BDKRB1/Ca2+/CaMKII/MEK1/ERK axis. Respir Res. 2025 Apr 28;26(1):168. doi: 10.1186/s12931-025-03240-7. PMID: 40296124; PMCID: PMC12038983.
原文鏈接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC12038983/

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