過表達(dá)人源PLA2R1小鼠膜性腎病模型的介紹與應(yīng)用

膜性腎�。╩embranous nephropathy, MN）是成年人中非糖尿病性腎病綜合征最常見的病因之一。約80%的病例為腎臟局限性（原發(fā)性MN），其余20%則與其他系統(tǒng)性疾病或外源性因素相關(guān)（繼發(fā)性MN）。大約三分之一的患者可以達(dá)到緩解，三分之一的患者病情穩(wěn)定，而另外三分之一的患者則會出現(xiàn)進(jìn)行性的腎功能喪失和持續(xù)的蛋白尿^[1]。

由基底膜下免疫復(fù)合物沉積引起的自身免疫反應(yīng)是MN的主要致病機(jī)制。近年來，諸如磷脂酶A2受體（phospholipase A2 receptor，PLA2R）和含有血小板反應(yīng)蛋白第1型結(jié)構(gòu)域的蛋白7A（(thrombospondin type I domain containing 7A，THSD7A）等自身抗原的發(fā)現(xiàn)，極大地推動(dòng)了人們對MN發(fā)病機(jī)制的理解。其中，磷脂酶A2受體（PLA2R）在足細(xì)胞上表達(dá)，在約70%的原發(fā)性膜性腎病患者中作為抗原存在。這些抗原能夠誘導(dǎo)以IgG4為主導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)，因此適合作為MN的診斷與監(jiān)測指標(biāo)。此外，補(bǔ)體系統(tǒng)的激活、遺傳易感基因以及環(huán)境污染也被認(rèn)為在MN的免疫反應(yīng)中發(fā)揮一定作用。

圖1. 原發(fā)性膜性腎病的發(fā)病機(jī)制^[2]。

然而，小鼠和大鼠的腎小球足細(xì)胞不表達(dá)PLA2R1，因此缺乏能模擬人類PLA2R1相關(guān)MN的動(dòng)物模型。2019年~2023年，Gunther Zahner及其團(tuán)隊(duì)發(fā)表過一系列研究，通過在足細(xì)胞過表達(dá)PLA2R1抗原，構(gòu)建了三種基于PLA2R1抗體的膜性腎病小鼠模型。

被動(dòng)免疫模型
研究人員構(gòu)建了在小鼠足細(xì)胞中特異性表達(dá)全長小鼠PLA2R1的模型，即：mPLA2R1 positive（BALB/c）小鼠^[3]。該小鼠本身無自發(fā)性腎病，但在注射Rabbit anti-mPLA2R1抗體后，觀察到同步的抗體生成和蛋白尿；被動(dòng)免疫3天后，尿蛋白開始有顯著差異，21天后降回平均值。病理在第7天也有顯著差異，同時(shí)觀察到補(bǔ)體激活^[3]。

局限性：
使用的是兔源性抗體，而非人類自身抗體。
為被動(dòng)免疫模型，尚不能研究B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)。

圖2. mPLA2R1被動(dòng)免疫模型^[3]。

純自發(fā)模型
研究人員構(gòu)建了Rosa26-CAG-Stop-hPLA2R1（Balb/c）小鼠，通過與NPHS2-Cre小鼠交配，實(shí)現(xiàn)足細(xì)胞特異性表達(dá)人PLA2R1模型^[4]。

在hPLA2R1 過表達(dá)小鼠中，尿蛋白從4周齡開始增加，腎臟IgG 沉積；同時(shí)對腎臟組織的抗體洗脫后能夠結(jié)合human PLA2R1，表明小鼠對人PLA2R1蛋白發(fā)生了免疫反應(yīng)。同時(shí)，3周齡的hPLA2R1 過表達(dá)小鼠在循環(huán)中有anti-PLA2R1 antibody產(chǎn)生，并隨周齡增加。5~6周齡有腹水等，12周齡因小鼠狀態(tài)終止實(shí)驗(yàn)，表現(xiàn)為嚴(yán)重的腎小球和腎小管間質(zhì)損傷。且在Rag2^-/-小鼠（缺乏T/B細(xì)胞）即使過表達(dá)hPLA2R1，也不產(chǎn)生抗體，也未出現(xiàn)蛋白尿或腎損傷，證明該模型是真正的自身免疫模型，而非轉(zhuǎn)基因本身毒性^[4]。

局限性：
疾病進(jìn)展較快（6周內(nèi)嚴(yán)重），可能不完全模擬人類慢性過程。

圖3. hPLA2R1自發(fā)模型^[4]。

主動(dòng)免疫模型
由于純自發(fā)模型發(fā)病過快，研究人員構(gòu)建了“嵌合體”PLA2R1小鼠chPLA2R1（將人源PLA2R1的3個(gè)N端結(jié)構(gòu)域“CysR、FnII、CTLD1”與鼠源PLA2R1的7個(gè)C端結(jié)構(gòu)域CTLD2-8融合而構(gòu)建），隨后與NPHS2-Cre小鼠交配，實(shí)現(xiàn)足細(xì)胞特異性表達(dá)人PLA2R1模型。該模型通過主動(dòng)免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生抗PLA2R1抗體，成功模擬了人類PLA2R1相關(guān)膜性腎病的關(guān)鍵臨床、免疫和組織學(xué)特征^[5]。

該小鼠到6月齡無自發(fā)異常（無自發(fā)抗體產(chǎn)生、無蛋白尿、無腎損傷）。用人源PLA2R1蛋白+溫和佐劑（TiterMax Gold）免疫該小鼠，抗人PLA2R1抗體于免疫后第5周出現(xiàn)（可能更早），識別位點(diǎn)與人類患者相似；蛋白尿從第3周開始升高，第6周顯著加重，出現(xiàn)嚴(yán)重腎病綜合征^[5]。

圖4. chPLA2R1主動(dòng)免疫模型^[5]。

南模生物膜性腎病模型
基于上述報(bào)道，南模生物通過在C57BL/6 背景下誘導(dǎo)足細(xì)胞特異性表達(dá)人源PLA2R1，建立了一種由抗體介導(dǎo)的自發(fā)膜性腎病模型。

這些小鼠自發(fā)地產(chǎn)生抗人源PLA2R1抗體，并表現(xiàn)為進(jìn)行性白蛋白尿和高脂血癥等腎病綜合征典型特征。在病理形態(tài)方面，其腎組織呈現(xiàn)出典型的膜性腎病形態(tài)學(xué)特征：免疫熒光檢測可見小鼠IgG在腎小球呈顆粒狀沉積，電子顯微鏡下則觀察到足細(xì)胞下方的電子致密沉積物。

該模型能精確模擬人類膜性腎病的病理特征，如腎小管足細(xì)胞的損傷、免疫復(fù)合物沉積、蛋白尿等，同時(shí)避免了Balb/c背景的人PLA2R1過表達(dá)小鼠死亡過快的情況，為研究PLA2R1在膜性腎病中的作用提供了有效工具。此外，南模正在繼續(xù)開發(fā)BALB/c背景hPLA2R1過表達(dá)小鼠并內(nèi)部測試陽性藥效果，以為后續(xù)臨床前藥效評價(jià)提供參考。
R26-CAG-LSL-hPLA2R1-IRES-EGFP
NM-KI-220264

圖5. R26-CAG-LSL-hPLA2R1-IRES-EGFP; NPHS2-Cre小鼠體重和存活率結(jié)果。足細(xì)胞特異性過表達(dá)人源PLA2R1的小鼠體重增長減緩，死亡率升高。

圖7. R26-CAG-LSL-hPLA2R1-IRES-EGFP; NPHS2-Cre小鼠血生化結(jié)果。足細(xì)胞特異性過表達(dá)人源PLA2R1的小鼠從4/6周齡開始出現(xiàn)血液生化指標(biāo)異常（n=7/group）。


圖8. R26-CAG-LSL-hPLA2R1-IRES-EGFP; NPHS2-Cre小鼠腎臟hPLA2R1的免疫熒光染色。足細(xì)胞特異性過表達(dá)人源PLA2R1小鼠表現(xiàn)出持續(xù)的PLA2R1表達(dá)。​

圖9. R26-CAG-LSL-hPLA2R1-IRES-EGFP; NPHS2-Cre小鼠腎臟腎臟mIgG（綠色）與lamin A/C（紅色）的免疫熒光染色�？傮w來看，足細(xì)胞特異性過表達(dá)人源PLA2R1小鼠腎臟IgG沉積增多，主要沿腎小球基底膜分布。

圖10. R26-CAG-LSL-hPLA2R1-IRES-EGFP; NPHS2-Cre小鼠腎組織PSA染色與病理分析。足細(xì)胞特異性過表達(dá)人源PLA2R1小鼠出現(xiàn)明顯腎損傷，包括間質(zhì)損害、腎小管擴(kuò)張、管型形成及基底膜增厚。