神經(jīng)類和血管類Cre漏表達(dá)的區(qū)別及應(yīng)對(duì)策略的深入探討

在利用Cre-loxP系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞特異性基因操作的研究中，每一個(gè)研究者最怕的可能就是在非目標(biāo)組織中發(fā)現(xiàn)Cre活性漏表達(dá)。一旦遇到這種情況，第一個(gè)反應(yīng)往往是：我這批小鼠還能用嗎？實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是不是都廢了？

答案是：不要慌！漏表達(dá)并不等同于不可用。許多廣泛使用、并被領(lǐng)域公認(rèn)的Cre品系本身也存在不同程度的泄漏。關(guān)鍵在于正確理解泄漏的來源、評(píng)估其對(duì)實(shí)驗(yàn)的具體影響，并通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)幕�因型鑒定來規(guī)避誤讀。本文將深入探討神經(jīng)類和血管類Cre漏表達(dá)的區(qū)別及應(yīng)對(duì)策略。

01 神經(jīng)類Cre鼠生殖泄漏
神經(jīng)科學(xué)研究中常用的Cre品系，如Nestin-Cre，Emx1-Cre或Camk2a-Cre，通常被認(rèn)為具有較高的神經(jīng)元特異性^[1]。然而，大量研究證實(shí)，神經(jīng)類Cre鼠和flox鼠交配，可能出現(xiàn)大量生殖泄漏的情況，當(dāng)Cre在生殖細(xì)胞（精子或卵子） 中發(fā)生泄漏表達(dá)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致flox區(qū)域在配子形成過程中就被刪除，從而直接傳遞給后代。

你本以為后代基因型是“Cre陰性; flox陽性”的對(duì)照組小鼠，實(shí)際上其全身所有細(xì)胞可能都已經(jīng)是“雜合或純合敲除”型了，因?yàn)樗鼈儚氖芫�卵開始就繼承了已被刪除的等位基因。但因?yàn)檫@些品系的核心驅(qū)動(dòng)效率足夠強(qiáng)，在目標(biāo)細(xì)胞群中能實(shí)現(xiàn)高效、特異的基因重組。所以仍然被廣泛認(rèn)可和使用。

如何應(yīng)對(duì)？
遇到生殖泄漏嚴(yán)重的Cre鼠，與flox鼠交配后，要盡早對(duì)子代鼠嚴(yán)格進(jìn)行雙品系基因型的鑒定和篩選。

雙陽性鼠的鑒定，包括對(duì)Cre和flox基因型的鑒定，flox基因型需要同時(shí)確認(rèn)flox是否敲入，以及KO條帶的有無。如果子代出現(xiàn)Cre陰性，flox陰性，KO陽性的基因型，說明親本Cre鼠已經(jīng)出現(xiàn)嚴(yán)重的生殖泄漏，需要及時(shí)剔除這樣的親本和子代小鼠；同時(shí)也要剔除Cre陽性，flox陰性，有KO條帶的子代鼠，避免生殖泄漏范圍進(jìn)一步擴(kuò)大。這樣通過對(duì)后代進(jìn)行嚴(yán)格的基因型鑒定，以確保敲除是組織特異性的而非全身性的。

02 血管類Cre泄漏：基因型檢測的陷阱
常用的血管內(nèi)皮細(xì)胞Cre品系，如 Tie2-Cre 和Cdh5-Cre，都有一個(gè)特點(diǎn)^[2]：在通過鼠尾或腳趾進(jìn)行基因型鑒定時(shí)，你很可能在幾乎所有組織（包括血液細(xì)胞）的DNA樣本中都能檢測到Cre介導(dǎo)的重組信號(hào)，即flox+KO嵌合；Cre陽性的基因型。

為什么會(huì)這樣？
這是因?yàn)檫@些基因的啟動(dòng)子在胚胎發(fā)育早期（如在造血干細(xì)胞中）就有短暫但廣泛的活性。這些早期表達(dá)Cre的細(xì)胞及其后代（包括各種血細(xì)胞）會(huì)永久地?cái)y帶重組的基因，因此從這些細(xì)胞中提取的DNA會(huì)永遠(yuǎn)呈現(xiàn)陽性信號(hào)。這通常不影響體內(nèi)實(shí)驗(yàn)， 在成年小鼠的體內(nèi)，這些Cre的表達(dá)通常會(huì)被限制在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，具有很高的特異性。

如何應(yīng)對(duì)與驗(yàn)證？
基因型PCR檢測的是“DNA是否被重組過”，而不是“Cre現(xiàn)在是否在表達(dá)”。陽性信號(hào)只代表動(dòng)物體內(nèi)存在一些發(fā)生過重組的細(xì)胞，并不代表你的目標(biāo)組織（如心臟、大腦的血管）被特異性敲除了。

如果擔(dān)心Cre有漏表達(dá)現(xiàn)象，可先通過基因型鑒定，篩選出flox+KO嵌合；Cre陽性的基因型。再通過免疫組化（IHC） 或免疫熒光（IF），在組織切片水平直接觀察你的目標(biāo)基因蛋白是否在血管內(nèi)皮細(xì)胞中被成功敲除，同時(shí)在其他細(xì)胞類型（如周圍的平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)元、血細(xì)胞）中是否仍然存在^[3]。這是證明其體內(nèi)特異性的最直接證據(jù)。

血管類Cre鼠的泄漏信號(hào)是發(fā)育的痕跡，不代表成年期特異性喪失。只要通過組織學(xué)驗(yàn)證其在體內(nèi)的內(nèi)皮特異性，它們就完全可以正常使用。

如果遇到構(gòu)建好的Cre鼠出現(xiàn)嚴(yán)重生殖泄漏，完全篩選不出特異性的后代，此時(shí)可優(yōu)先選擇用誘導(dǎo)型CreER鼠代替Cre鼠，該小鼠只有在給予他莫昔芬（Tamoxifen）后，CreER才會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用，這可以極大地控制重組發(fā)生的時(shí)間，并有效避免發(fā)育早期或生殖系中的泄漏表達(dá)。

圖1. Tamoxifen誘導(dǎo)的Cre-ER系統(tǒng)原理^[4]

總之，沒有完美的Cre，幾乎所有Cre品系都存在某種程度的泄漏，這是由啟動(dòng)子特性、插入位點(diǎn)、表觀遺傳等多種因素決定的。

遇到Cre漏表達(dá)，首先要做的是科學(xué)的診斷，而不是恐慌性的廢棄。理解泄漏的性質(zhì)，設(shè)計(jì)合理的鑒定和篩選方法，你的實(shí)驗(yàn)依然可以產(chǎn)出可信的數(shù)據(jù)。

往期推文：
小鼠大學(xué)問 | Cre-Lox系統(tǒng)核心原理全解析
小鼠大學(xué)問 | Cre-lox系統(tǒng)的常見問題匯總

參考文獻(xiàn)：
[1] Madison, L., et al. (2015). A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nature Neuroscience, 18(6), 793–802.

[2] Alva, J. A., et al. (2006). VE-Cadherin-Cre-recombinase transgenic mouse: a tool for lineage analysis and gene deletion in endothelial cells. Developmental Dynamics, 235(3), 759–767.

[3] Tang, S., et al. (2010). A Cre recombination-based reporter system for mapping and manipulating neural circuits. Nature Protocols, 5(6), 1086–1100. 

[4] Kim H, Kim M, Im SK, Fang S.Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles oftarget genes. Lab Anim Res. 2018;34(4):147‐159. doi:10.5625/lar.2018.34.4.147.

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