crRNA驅(qū)動級聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)ctDNA中PIK3CA H1047R突變的超靈敏檢測

循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）作為癌癥早期診斷和動態(tài)監(jiān)測的關(guān)鍵生物標(biāo)志物，其超靈敏檢測面臨核心挑戰(zhàn)。早期患者ctDNA突變等位基因頻率（VAF）常低于0.1%，而傳統(tǒng)組織活檢因侵入性風(fēng)險、腫瘤異質(zhì)性及樣本可及性限制難以滿足實(shí)時監(jiān)測需求。現(xiàn)有高靈敏度技術(shù)如液滴數(shù)字PCR（ddPCR）和二代測序（NGS）雖可檢測低豐度突變，但前者依賴熱循環(huán)儀與復(fù)雜設(shè)備，后者需繁瑣的文庫構(gòu)建和生物信息學(xué)分析，且成本高昂，難以適配床旁檢測場景。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)雖規(guī)避了熱循環(huán)限制，卻易受非特異性擴(kuò)增干擾，制約檢測準(zhǔn)確性。

CRISPR/Cas系統(tǒng)憑借高特異性靶向能力為分子診斷帶來突破，其中Cas14a因其最小化結(jié)構(gòu)、單鏈DNA特異性切割及無需PAM序列的特性，展現(xiàn)出優(yōu)于Cas12a的識別穩(wěn)定性。然而，CRISPR直接檢測靈敏度通常僅達(dá)皮摩爾級，難以滿足早期癌癥ctDNA檢測需求。研究通過創(chuàng)新性整合RPA擴(kuò)增與CRISPR/Cas14a系統(tǒng)，利用二者最適溫度匹配的特性，構(gòu)建雙重優(yōu)化機(jī)制，RPA實(shí)現(xiàn)目標(biāo)指數(shù)富集提升靈敏度，Cas14a特異性切割消除非特異背景信號，為超靈敏檢測奠定基礎(chǔ)。

乳腺癌全球年新發(fā)病例超230萬，PIK3CA H1047R突變通過組成性激活PI3Kα通路驅(qū)動內(nèi)分泌治療耐藥，其早期檢測對改善預(yù)后至關(guān)重要。基于此，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科龐達(dá)、張顯玉團(tuán)隊(duì)在這項(xiàng)研究中，通過T7酶選擇性消化RPA擴(kuò)增產(chǎn)物反義鏈，實(shí)現(xiàn)無熱循環(huán)的ssDNA轉(zhuǎn)化；進(jìn)一步采用工程化crRNA設(shè)計(jì)合成單核苷酸錯配，將CRISPR/Cas14a單堿基分辨率應(yīng)用于PIK3CA H1047R突變特異性識別，在32例臨床樣本中實(shí)現(xiàn)與ddPCR相當(dāng)?shù)?00%敏感性與特異性，且檢測限達(dá)0.01%。該系統(tǒng)結(jié)合數(shù)字微流控芯片，可在37℃下60分鐘內(nèi)完成檢測，為精準(zhǔn)腫瘤學(xué)提供可擴(kuò)展的床旁診斷平臺。研究成果發(fā)表于“Advanced science”期刊，題為“Engineered crRNA Drives RPA-T7-CRISPR/Cas14a Cascade for Ultrasensitive Detection of ctDNA PIK3CA H1047R”。

首先，為了滿足ctDNA中SNP的超靈敏檢測，研究人員開發(fā)了TIDE-Cas14a系統(tǒng)。從血漿提取的ctDNA直接加入包含RPA擴(kuò)增試劑、T7外切酶、Cas14a蛋白及工程化crRNA的預(yù)混體系。先將RPA在37℃等溫條件下對目標(biāo)序列進(jìn)行指數(shù)級擴(kuò)增，生成雙鏈DNA（dsDNA）產(chǎn)物；隨后，T7外切酶特異性降解磷酸化修飾的反義鏈，保留PT修飾的正義鏈，完成無需熱循環(huán)的ssDNA轉(zhuǎn)化。關(guān)鍵在于crRNA的合成錯配設(shè)計(jì)，通過在非種子區(qū)引入單核苷酸取代，顯著增強(qiáng)Cas14a/crRNA-ssDNA復(fù)合物對靶標(biāo)結(jié)合的特異性，即使野生型與突變序列同源性超99.9%，系統(tǒng)仍能精準(zhǔn)識別PIK3CA H1047R等單堿基變異。靶標(biāo)結(jié)合觸發(fā)Cas14a的側(cè)切活性，切割ssDNA熒光探針，釋放可實(shí)時檢測的熒光信號。進(jìn)一步結(jié)合數(shù)字微流控芯片技術(shù)，將反應(yīng)體系分割為10^5個納米級液滴進(jìn)行并行檢測，通過熒光顯微鏡定量陽性信號比例，使靈敏度提升至attomolar級別，檢測全程在60分鐘內(nèi)完成，且與ddPCR相比展現(xiàn)出100%的臨床符合率。

圖1    TIDE-Cas14a系統(tǒng)的工作流程

然后，為提升PIK3CA H1047R突變檢測特異性，研究人員將合成錯配策略應(yīng)用于Cas14a系統(tǒng)。基于Cas14a對種子區(qū)堿基高度敏感的特性，通過系統(tǒng)引入單核苷酸錯配優(yōu)化crRNA設(shè)計(jì)（圖2B）。在SNP位點(diǎn)上下游7個位置構(gòu)建六種crRNA變體，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)+1或+3位點(diǎn)引入錯配可顯著增強(qiáng)突變體/野生型區(qū)分能力（圖2D-I）。其中+1位點(diǎn)錯配crRNA使信噪比提升三倍，被選為PIK3CA檢測最優(yōu)方案。

圖2    通過對crRNA進(jìn)行工程化改造以提高信噪比

為了驗(yàn)證該策略的實(shí)用型，進(jìn)一步驗(yàn)證于肺癌和結(jié)直腸癌關(guān)鍵驅(qū)動突變。研究人員采用了相同的crRNA設(shè)計(jì)原理，在肺和結(jié)直腸癌中進(jìn)行關(guān)鍵的致癌突變，包括EGFR T790M、EGFR L858R、BRAF V600E及KRAS G12V，均實(shí)現(xiàn)單堿基分辨（圖3B/D/F/H）。分子對接模擬顯示含錯配crRNA的三元復(fù)合物結(jié)合野生型DNA時對接評分顯著降低，表明其結(jié)合能下降。尤其對于EGFR L858R，原始crRNA與錯配crRNA-2均能有效區(qū)分突變，與對接評分未顯著變化的現(xiàn)象一致，證實(shí)錯配設(shè)計(jì)通過破壞Cas14a與野生型序列的親和力提升特異性。

圖3    工程化crRNA實(shí)現(xiàn)了對臨床相關(guān)致癌突變的特異性檢測

接著，研究人員通過系統(tǒng)篩選PIK3CA H1047R擴(kuò)增引物，確定F1R1引物對在39℃/20分鐘條件下可實(shí)現(xiàn)高效特異性擴(kuò)增（圖4C-E）。將RPA擴(kuò)增與T7-CRISPR/Cas14a檢測整合為單管反應(yīng)體系，經(jīng)兩步法預(yù)驗(yàn)證可行性后，重點(diǎn)優(yōu)化關(guān)鍵組分參數(shù)，Cas14a與sgRNA以1:1比例協(xié)同作用時熒光信號最強(qiáng)，同時探針濃度優(yōu)化至625 nM以平衡信噪比（圖4G-I）；T7外切酶濃度≥2.5 U/μL即可完成鏈轉(zhuǎn)換，且不產(chǎn)生背景噪聲（圖4J）；37℃恒溫反應(yīng)60分鐘實(shí)現(xiàn)檢測全程閉環(huán)（圖4K）。最終確立最優(yōu)體系包含480 nM RPA引物、625 nM Cas14a/sgRNA復(fù)合物、625 nM ssDNA探針及2.5 U/μL T7酶。功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，僅當(dāng)目標(biāo)ctDNA（1 ng/μL）激活完整反應(yīng)體系時，Cas14a的側(cè)切活性可特異性切割FAM-BHQ1探針釋放熒光，證實(shí)目標(biāo)依賴的信號放大機(jī)制。該優(yōu)化方案使檢測限達(dá)0.01%，為后續(xù)臨床驗(yàn)證奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

圖4    TIDE-Cas14a系統(tǒng)的建立與優(yōu)化

為了評估用于核酸分析TIDE-Cas14a系統(tǒng)的定量能力和適用性，研究人員通過細(xì)胞系gDNA梯度稀釋實(shí)驗(yàn)證實(shí)其檢測限（LOD）達(dá)0.01% VAF（圖5C-E）。在模擬生理?xiàng)l件下，系統(tǒng)對PIK3CA H1047R突變表現(xiàn)出優(yōu)異定量能力。ΔF與VAF對數(shù)值線性相關(guān)，且微流控芯片在0.001% VAF時仍可檢測單分子信號（圖5C）。特異性驗(yàn)證顯示系統(tǒng)可精準(zhǔn)區(qū)分突變亞型，無交叉反應(yīng)（圖5G），有效規(guī)避腫瘤異質(zhì)性干擾。與金標(biāo)準(zhǔn)ddPCR的對比實(shí)驗(yàn)采用相同樣本。ddPCR的檢測閾值為0.1% VAF，而TIDE-Cas14a在0.01% VAF仍穩(wěn)定檢出，靈敏度提升10倍（圖5I）。重復(fù)性驗(yàn)證涵蓋不同操作者、試劑批次及實(shí)驗(yàn)日期，熒光信號變異系數(shù)<5%，證實(shí)系統(tǒng)具備臨床診斷級穩(wěn)定性。

圖5    TIDE-Cas14a系統(tǒng)在檢測細(xì)胞系基因組DNA中PIK3CA H1047R突變的性能分析

接下來，為了評估TIDE-Cas14a系統(tǒng)在臨床實(shí)踐中的敏感特異性，研究人員收集了來自32例乳腺癌患者的組織與血漿樣本，TIDE-Cas14a系統(tǒng)展現(xiàn)出zhuoyue性能，與組織ddPCR結(jié)果相比，檢測敏感性與特異性均達(dá)100%（圖6C）；血漿ctDNA檢測中，系統(tǒng)檢出率顯著優(yōu)于ddPCR，成功捕獲ddPCR漏診的2例IA期患者的微弱突變信號（圖6D-E）；對低豐度ctDNA的檢出能力，證實(shí)其在早期腫瘤及微小殘留病灶監(jiān)測中的潛力。

圖6    使用TIDE-Cas14a系統(tǒng)和ddPCR在臨床樣本中檢測PIK3CA H1047R突變

最后，研究人員將TIDE-Cas14a系統(tǒng)與自研數(shù)字微流體芯片整合，構(gòu)建可定量檢測血漿PIK3CA H1047R突變的微流控平臺（圖7A-C）。芯片采用三層結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，上下玻璃層與含10^5微腔陣列的PDMS芯片體，通過虹吸效應(yīng)實(shí)現(xiàn)檢測液快速填充，避免堵塞風(fēng)險。微腔密度較傳統(tǒng)數(shù)字PCR提升兩個數(shù)量級，顯著增強(qiáng)稀有突變信號捕獲能力。臨床驗(yàn)證中，芯片基于熒光強(qiáng)度半定量分級策略，在32例乳腺癌樣本中與常規(guī)TIDE-Cas14a檢測結(jié)果高度一致，精準(zhǔn)識別5例陽性樣本（圖7C）。雖暫未實(shí)現(xiàn)絕對定量，但其在>95%野生型背景下的突變識別能力已有所突破。該系統(tǒng)通過微腔并行反應(yīng)將靈敏度推升至單分子級，且芯片制造采用可規(guī)�；�的PDMS復(fù)制成型工藝，成本較商用數(shù)字PCR降低80%。該技術(shù)為腫瘤突變篩查提供兼具超靈敏、低成本特性的床旁診斷新方案。

圖7    TIDE-Cas14a系統(tǒng)與數(shù)字微流控芯片的聯(lián)用

總之，研究開發(fā)的TIDE-Cas14a平臺通過三重創(chuàng)新突破液體活檢瓶頸，融合RPA等溫?cái)U(kuò)增、T7外切酶鏈轉(zhuǎn)換及CRISPR/Cas14a特異性切割，37℃恒溫1小時內(nèi)完成檢測；在crRNA特定位置引入G/C堿基錯配，實(shí)現(xiàn)單堿基分辨率，靈敏度較ddPCR提升10倍；集成10萬微腔陣列，單分子檢測能力達(dá)0.001% VAF，成本降低80%。臨床驗(yàn)證顯示，32例乳腺癌樣本中與組織活檢一致性達(dá)100%，并成功檢出ddPCR遺漏的早期患者。該系統(tǒng)突破傳統(tǒng)方法在低豐度突變檢測中的局限，支持PIK3CA、EGFR等關(guān)鍵驅(qū)動基因分析，為早期癌癥診斷、MRD監(jiān)測提供床旁解決方案。

參考文獻(xiàn)：Y. Yu, M. Jin, W. Yuan, et al. “ Engineered crRNA Drives RPA-T7-CRISPR/Cas14a Cascade for Ultrasensitive Detection of ctDNA PIK3CA H1047R.” Adv. Sci. (2025): e07126.
原文鏈接：https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202507126

圖片來源：所有圖片均來源于參考文獻(xiàn) 

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