IFN-γ通過抑制Caspase 7加劇CAR-T細(xì)胞肺損傷的研究

CAR-T細(xì)胞攻擊表達(dá)靶抗原的非腫瘤細(xì)胞造成的“在靶脫腫瘤”（On target off tumor）效應(yīng)是阻礙CAR-T治療血液腫瘤或?qū)嶓w瘤臨床實(shí)踐的關(guān)鍵障礙，是造成CAR-T細(xì)胞引發(fā)嚴(yán)重器官損傷的重要原因之一。目前臨床上處理該不良反應(yīng)主要通過大劑量激素，或給CAR-T細(xì)胞裝配安全開關(guān)，但上述方法都會(huì)大幅度損傷CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤療效。深入解析on target off tumor毒性的精確機(jī)制，將有助于建立新型干預(yù)策略。

近日，徐州醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞治療藥物產(chǎn)業(yè)學(xué)院施明教授，鄭駿年教授團(tuán)隊(duì)利用人Her2轉(zhuǎn)基因小鼠和靶向人Her2的小鼠CAR-T細(xì)胞構(gòu)建了CAR-T細(xì)胞致免疫健全小鼠急性肺損傷的研究模型，揭示了靶向Her2的CAR-T細(xì)胞造成急性肺損傷的分子調(diào)控機(jī)制，并有針對(duì)性地提出了預(yù)防該不良反應(yīng)的策略。該研究成果于2025年3月20日發(fā)表于Molecular Therapy。

圖片來源：《Molecular Therapy》
（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40119519/）

研究材料與方法
在該研究中，研究人員利用靶向Her2的小鼠CAR-T細(xì)胞攻擊Her2轉(zhuǎn)基因小鼠作為動(dòng)物模型，使用CAR-T細(xì)胞攻擊過表達(dá)Her2的小鼠I型肺泡上皮細(xì)胞系MLE12-Her2深入探究了CAR-T細(xì)胞造成急性肺損傷的分子機(jī)制。同時(shí)采用在CAR-T細(xì)胞攻擊過程中加入IFN-γ中和抗體，以及使用Prf基因敲除鼠，Gzmb基因敲除鼠（由賽業(yè)生物提供）來源的腹膜淋巴結(jié)制備CAR-T細(xì)胞，以分別探究IFN-γ，Prf和GzmB在CAR-T細(xì)胞致急性肺損傷中發(fā)揮的不同功能。根據(jù)闡明的機(jī)制，研究者還提出了在CAR-T細(xì)胞輸注同時(shí)中和IFN-γ的不良反應(yīng)對(duì)抗策略，并在動(dòng)物模型中進(jìn)行驗(yàn)證。

技術(shù)路線
01 利用Her2轉(zhuǎn)基因小鼠模型，評(píng)估CAR-T細(xì)胞造成急性肺損傷的特征
02 建立體外模型探究CAR-T細(xì)胞致急性肺損傷的分子機(jī)制
03 探究IFN-γ，Prf和GzmB在CAR-T細(xì)胞致急性肺損傷中發(fā)揮的不同功能
04 在動(dòng)物模型中驗(yàn)證中和IFN-γ對(duì)抗急性肺損傷防控策略的可行性

研究結(jié)果
1 Her2 CAR-T細(xì)胞直接攻擊小鼠肺造成肺損傷
為了模擬CAR-T細(xì)胞引起的急性肺損傷，研究者將Her2-CAR-T細(xì)胞輸注小鼠的血液循環(huán)中。注射后6小時(shí)，采集肺部進(jìn)行HE染色。結(jié)果顯示，Her2 CAR-T細(xì)胞靶向Her2轉(zhuǎn)基因小鼠的肺部，導(dǎo)致充血、肺泡間隔彌漫性增厚、肺泡結(jié)構(gòu)惡化和炎性細(xì)胞浸潤等病理變化（圖1a），并且造成肺部滲出增加（圖1b）。這些結(jié)果表明，Her2-CAR-T細(xì)胞對(duì)肺組織的攻擊具有靶點(diǎn)特異性。此外，注射到循環(huán)系統(tǒng)中的Her2-CAR-T細(xì)胞主要積聚在肺部，（圖1c-d）。CAR-T細(xì)胞的這種分布特征可能部分解釋了其造成急性肺損傷的必然性。Western Blot結(jié)果表明，由于CAR-T細(xì)胞攻擊的肺部中的切割，凋亡相關(guān)蛋白Caspase 3和Caspase 7被激活（圖1e）。因此，研究人員認(rèn)為Her2-CAR-T細(xì)胞通過直接靶向小鼠肺泡上皮細(xì)胞，導(dǎo)致以凋亡為特征的急性肺損傷。

圖1 CAR-T細(xì)胞造成小鼠急性肺損傷^[1]

2 Caspase 7在CAR-T細(xì)胞對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的損傷中起保護(hù)作用
為了研究CAR-T細(xì)胞誘導(dǎo)的肺損傷的內(nèi)在分子機(jī)制，研究人員建立了Her2-CAR-T細(xì)胞攻擊小鼠I型肺泡上皮細(xì)胞系MLE12-Her2的體外模型（圖2a）。CAR-T細(xì)胞攻擊導(dǎo)致MLE12-Her2細(xì)胞中Caspase 3和7的切割（圖2b），這與體內(nèi)現(xiàn)象一致。值得注意的是，CAR-T細(xì)胞誘導(dǎo)的Caspase 7切割導(dǎo)致全長Caspase 7水平顯著降低（圖2b）。因此，研究人員猜測Her2 CAR-T細(xì)胞攻擊可能在介導(dǎo)靶細(xì)胞Caspase 7的切割，同時(shí)下調(diào)Caspase 7蛋白的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，研究者探究了Caspase 7在CAR-T細(xì)胞誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用。

研究人員使用AAV腺病毒敲低小鼠肺部Caspase 7表達(dá)后（圖2c）使用CAR-T細(xì)胞攻擊，結(jié)果表明Caspase 7敲除小鼠經(jīng)歷了更嚴(yán)重的肺損傷（圖2d）。這表明Caspase 7在CAR-T細(xì)胞誘導(dǎo)的肺損傷中起著保護(hù)作用，其表達(dá)減少可能會(huì)加劇這種損傷。為了進(jìn)一步證實(shí)Caspase 7在CAR-T細(xì)胞攻擊中的作用，研究人員構(gòu)建了Caspase 7敲除或過表達(dá)的MLE12-Her2細(xì)胞，并用兩種熒光染料標(biāo)記，以評(píng)估CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用（圖2e）。結(jié)果顯示，與MLE12-Her2Caspase 7 KO靶細(xì)胞相比，MLE12-Her2Caspase 7OE細(xì)胞在CAR-T細(xì)胞攻擊下表現(xiàn)出更高的存活率和更低的凋亡水平（圖2e）。這些發(fā)現(xiàn)均說明，Caspase 7在CAR-T細(xì)胞攻擊肺泡上皮細(xì)胞的場景中起保護(hù)作用。

圖2 CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)靶細(xì)胞Caspase 7下調(diào)加重肺損傷^[1]

圖3 中和IFN-γ可逆轉(zhuǎn)CAR-T細(xì)胞造成的急性肺損傷^[1]

4 在CAR-T細(xì)胞輸注過程中中和IFN-γ可以改善急性肺損傷，但不會(huì)損害抗腫瘤療效
在明確了IFN-γ在CAR-T細(xì)胞造成急性肺損傷過程中的核心作用后，研究者提出了在CAR-T細(xì)胞輸注的同時(shí)給與IFN-γ中和抗體的不良反應(yīng)防控策略。研究結(jié)果表明，輸注的中和抗體能夠顯著抑制CAR-T細(xì)胞輸注12-24小時(shí)內(nèi)小鼠血清中IFN-γ的分泌高峰，但是不影響最終抗腫瘤的效應(yīng)（圖4）。
 

圖4 中和IFN-γ可防止CAR-T細(xì)胞造成的急性肺損傷，但不影響抗腫瘤功能^[1]