關(guān)于揭示DUSP18調(diào)控結(jié)直腸癌免疫逃逸分子機(jī)制的研究

結(jié)直腸癌（CRC）是全球發(fā)病率第三高、致死率第二高的惡性腫瘤。目前，僅有15%的CRC患者能夠從免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）治療中獲益。一個(gè)重要原因在于腫瘤細(xì)胞對(duì)其新陳代謝進(jìn)行重編程以產(chǎn)生專門的代謝物，這些代謝物既能促進(jìn)自身的生長(zhǎng)，又能促進(jìn)腫瘤免疫逃避，即腫瘤以促進(jìn)浸潤(rùn)C(jī)D8+ T細(xì)胞耗竭和失活的方式重塑其微環(huán)境，從而導(dǎo)致“免疫逃逸”的發(fā)生。然而，這些功能之間的關(guān)系尚不清楚。

2024年7月，武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李友軍教授團(tuán)隊(duì)在國(guó)際主流學(xué)術(shù)期刊《Nature communications》在線發(fā)表了題為“Inhibition of DUSP18 impairs cholesterol biosynthesis and promotes anti-tumor immunity in colorectal cancer”的研究論文。武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李友軍教授為該論文的通訊作者，生命科學(xué)學(xué)院博士研究生周小軍為該論文的第一作者。武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院與醫(yī)學(xué)研究院為該研究提供了技術(shù)和平臺(tái)支持。

該研究結(jié)直腸癌免疫逃逸這一現(xiàn)象為切入點(diǎn)，揭示了DUSP18作為新的調(diào)控膽固醇生物合成的因子，來促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中羊毛甾醇的積累進(jìn)而限制T細(xì)胞的活化，最終促進(jìn)CRC的免疫逃逸。

研究材料
在這項(xiàng)研究中，研究人員構(gòu)建了腸上皮細(xì)胞Dusp18條件性敲除小鼠模型（其中Dusp18條件性敲除小鼠模型由賽業(yè)生物提供）。體外研究則采用了Dusp18-KD的MC38和HCT116的細(xì)胞系

技術(shù)方法
研究人員采用了多種技術(shù)，包括CRISPR篩選、小鼠模型、細(xì)胞培養(yǎng)、流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化、蛋白質(zhì)、單細(xì)胞分析，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)等。

技術(shù)路線

研究結(jié)果
1.sgRNA文庫(kù)篩選鑒定DUSP18促進(jìn)CRC免疫逃逸
研究人員通過sgRNA文庫(kù)篩選，并尋找與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）評(píng)分負(fù)相關(guān)的交集基因，其中最值得注意的是Dusp18。與正常結(jié)直腸組織相比，CRC樣本中DUSP18 mRNA的表達(dá)水平也較高。在DUSP18 mRNA低表達(dá)的CRC患者中，CTL評(píng)分高的患者生存率更高，而DUSP18 mRNA高表達(dá)且CTL評(píng)分高的患者生存率更低。為了確定抑制Dusp18是否會(huì)影響T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤功能，研究人員在MC38 CRC細(xì)胞和表達(dá)卵清蛋白（OVA）的B16黑色素瘤（B16-OVA）細(xì)胞中進(jìn)行shRNA介導(dǎo)的Dusp18抑制。敲低Dusp18并不影響腫瘤細(xì)胞在體外的增殖或腫瘤在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。然而，抑制Dusp18確實(shí)會(huì)影響免疫功能正常小鼠中腫瘤生長(zhǎng)并延長(zhǎng)其生存時(shí)間，而清除CD8+ T細(xì)胞則可以消除敲低Dusp18引起的腫瘤生長(zhǎng)劣勢(shì)。因此，上述結(jié)果表明，DUSP18通過CD8+ T細(xì)胞依賴的方式來促進(jìn)CRC的免疫逃避。

圖1 抑制Dusp18表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞的功能

2.抑制DUSP18會(huì)影響膽固醇的生物合成
為了確定抑制DUSP18表達(dá)抗腫瘤免疫的分子機(jī)制，研究人員對(duì)shCtrl和shDusp18 MC38細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq分析。GO和KEGG分析顯示，shDusp18細(xì)胞中下調(diào)的基因主要是參與膽固醇生物合成及其下游代謝途徑�；�因集富集分析（GSEA）也顯示，與膽固醇穩(wěn)態(tài)相關(guān)的基因在對(duì)照細(xì)胞中呈正富集。隨后通過進(jìn)一步證實(shí)，在shDusp18 MC38細(xì)胞和CKO（腸道上皮特異性DUSP18缺失的小鼠）腫瘤組織中（由賽業(yè)生物構(gòu)建的小鼠），膽固醇生物合成基因的mRNA表達(dá)和蛋白水平下降。此外，研究人員還對(duì)shCtrl和shDUSP18人CRC HCT116細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq分析，以驗(yàn)證在小鼠MC38細(xì)胞中的結(jié)果。GO、KEGG和GSEA分析均顯示，抑制DUSP18可顯著降低膽固醇生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)�？傊�，上述研究結(jié)果都支持DUSP18通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膽固醇的生物合成來調(diào)控腫瘤相關(guān)的免疫環(huán)境。

圖2 抑制Dusp18表達(dá)降低膽固醇的生物合成

3.TME中的腫瘤細(xì)胞來源的羊毛甾醇促進(jìn)CD8+T細(xì)胞失活
研究人員后續(xù)猜想膽固醇生物合成途徑中的一種或多種中間產(chǎn)物可能是抑制CD8+T細(xì)胞功能的原因。利用膽固醇代謝組學(xué)測(cè)定MC38腫瘤間質(zhì)中這些中間產(chǎn)物代謝水平，發(fā)現(xiàn)下調(diào)幅度最大的是羊毛甾醇（40%）。為了直接確定其相關(guān)性，研究人員用羊毛甾醇處理原代CD8+T細(xì)胞，結(jié)果顯示羊毛甾醇以劑量依賴的方式降低CD8+T細(xì)胞的活化。據(jù)報(bào)道，羊毛甾醇可促進(jìn)HMG-CoA還原酶（HMGCR）的泛素化和蛋白酶體降解，而HMGCR是甲羥戊酸途徑中的限速酶。與此一致的是，研究人員發(fā)現(xiàn)在小鼠原代CD8+T細(xì)胞細(xì)胞中，羊毛甾醇處理降低HMGCR蛋白水平，進(jìn)一步抑制小鼠原代CD8+T細(xì)胞中的KRAS蛋白豐度以及ERK和AKT信號(hào)傳導(dǎo)。這些結(jié)果表明，腫瘤來源的羊毛甾醇作為一種免疫抑制代謝物，通過降低HMGCR蛋白水平從而影響KRAS-ERK信號(hào)傳導(dǎo)來限制CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能。

圖3 Dusp18驅(qū)動(dòng)的TME中的羊毛甾醇促進(jìn)CD8+T細(xì)胞失活

4.DUSP18 在CRC患者中過表達(dá)，可預(yù)測(cè)免疫荒漠
研究人員還進(jìn)一步利用CRC臨床樣本驗(yàn)證了本文發(fā)現(xiàn)的信號(hào)軸在腫瘤=組織中高度上調(diào)，也基于單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)DUSP18的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8 T細(xì)胞功能之間的相關(guān)性。

圖4 DUSP18 在 CRC 患者中過表達(dá)，可預(yù)測(cè)免疫荒漠

總結(jié)

圖5 DUSP18在促進(jìn)免疫逃避中的代謝作用^[1]

該研究結(jié)果揭示了DUSP18在促進(jìn)免疫逃避中的代謝作用。研究人員發(fā)現(xiàn)DUSP18抑制和免疫檢查點(diǎn)阻斷聯(lián)合使用可增強(qiáng)CRC小鼠模型中CD8+ T細(xì)胞的抗腫瘤活性。這提示了一種潛在的聯(lián)合治療形式，在靶向代謝和免疫因子的基礎(chǔ)上激活并維持CD8+ T細(xì)胞的抗腫瘤活性。

參考文獻(xiàn)：
Zhou, X., Wang, G., Tian, C., Du, L., Prochownik, E.V., and Li, Y. (2024). Inhibition of DUSP18 impairs cholesterol biosynthesis and promotes anti-tumor immunity in colorectal cancer. Nature Communications 15, 5851. 10.1038/s41467-024-50138-x.