抗鮑曼不動(dòng)桿菌高特異性人源單克隆抗體的開(kāi)發(fā)研究方法及結(jié)果

鮑曼不動(dòng)桿菌（A. baumannii）已成為醫(yī)療環(huán)境中的重大威脅，常導(dǎo)致免疫功能低下患者及重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）患者發(fā)生嚴(yán)重感染。這種病原體因極強(qiáng)的耐藥性和院內(nèi)傳播能力，被世界衛(wèi)生組織列為“關(guān)鍵優(yōu)先級(jí)細(xì)菌”。它們會(huì)在醫(yī)療器械表面形成頑固的生物膜，導(dǎo)致肺炎和膿毒癥等感染。

臨床上通常采用廣譜抗生素聯(lián)合用藥，但這種方法療效不佳，常導(dǎo)致住院時(shí)間延長(zhǎng)及死亡率上升。單克隆抗體（mAb）療法相對(duì)傳統(tǒng)抗生素而言具有特異性高和副作用小等優(yōu)勢(shì)。鮑曼不動(dòng)桿菌的外膜蛋白Omp38是關(guān)鍵致病因子，參與細(xì)菌黏附、侵襲和生物膜形成。之前的研究開(kāi)發(fā)出Omp38特異性鼠源單克隆抗體，但全人源抗體的相關(guān)研究仍處于空白。

近日，賽業(yè)生物和某高校的研究人員合作，使用HUGO-Ab^®全人源抗體小鼠以及Beacon單細(xì)胞光導(dǎo)平臺(tái)，開(kāi)發(fā)出Omp38特異性全人源單克隆抗體。這項(xiàng)研究成果于8月20日發(fā)表在《BMC Microbiology》雜志上，有望在臨床環(huán)境中改善鮑曼不動(dòng)桿菌感染的治療效果。張奕威、余文康是該文章的共同第一作者，賽業(yè)生物周順博士是該文章的通訊作者。

https://doi.org/10.1186/s12866-025-04283-y

研究材料與方法
在本項(xiàng)研究中，研究人員采用鮑曼不動(dòng)桿菌的外膜孔蛋白（Omp38）對(duì)HUGO-Ab®全人源抗體小鼠進(jìn)行免疫（該小鼠由賽業(yè)生物提供，基于賽業(yè)自主研發(fā)的TurboKnockout ES打靶技術(shù)）。經(jīng)過(guò)為期21天的免疫過(guò)程后，研究人員研磨小鼠脾臟，富集CD138陽(yáng)性漿細(xì)胞，并利用Beacon^®單細(xì)胞光導(dǎo)平臺(tái)篩選出60個(gè)分泌Omp38蛋白特異性抗體的陽(yáng)性漿細(xì)胞。隨后，通過(guò)漿細(xì)胞抗體基因擴(kuò)增及抗體體外重組表達(dá)，成功獲得5株Human IgG重組抗體。后續(xù)研究中，研究人員評(píng)估了這5株全人源抗體與Omp38蛋白及多種鮑曼不動(dòng)桿菌菌株的交叉結(jié)合能力，測(cè)試了這些單克隆抗體對(duì)細(xì)菌黏附和生物膜形成的抑制效果，并建立致死感染小鼠模型，驗(yàn)證其在體內(nèi)的保護(hù)作用。

技術(shù)路線

Omp38抗原免疫HUGO-Ab全人源抗體小鼠，產(chǎn)生強(qiáng)免疫應(yīng)答
↓
利用Beacon平臺(tái)篩選Omp38特異性單抗，并擴(kuò)增抗體基因
↓
評(píng)估Omp38特異性單抗的結(jié)合能力及其對(duì)細(xì)菌侵襲性的影響
↓
運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)單克隆抗體F2與Omp38的結(jié)合構(gòu)象
↓
建立致死感染小鼠模型，并驗(yàn)證Omp38特異性單抗的保護(hù)作用

研究結(jié)果
Omp38抗原免疫HUGO-Ab全人源單克隆抗體鼠并篩選抗體
研究人員使用了OMP免疫HUGO-Ab^®全人源單克隆抗體小鼠（由賽業(yè)生物提供）。在三輪免疫后，免疫組中Omp38特異性多克隆抗體的滴度顯著高于未免疫組（圖1A, 1B）。之后將抗體鼠脾臟中的CD138陽(yáng)性漿細(xì)胞上樣到Berkeley Lights Beacon^®單細(xì)胞光導(dǎo)平臺(tái)，基于分泌抗體與抗原微球的結(jié)合篩選陽(yáng)性漿細(xì)胞。通過(guò)OEP技術(shù)，在一張篩選芯片中導(dǎo)入了9021個(gè)漿細(xì)胞，其中2029個(gè)微腔分泌IgG抗體，而其中60個(gè)分泌Omp38蛋白特異性抗體（圖1C）。對(duì)這些分泌抗原特異性抗體的單B細(xì)胞全部導(dǎo)出，基于RT-PCR方法擴(kuò)增單B細(xì)胞抗體VH/VL序列。最終，實(shí)驗(yàn)人員獲得24對(duì)VH/VL配對(duì)的抗體序列。

免疫HUGO-Ab^®全人源單克隆抗體鼠產(chǎn)生Omp38特異性單B細(xì)胞

利用IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)分析互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）后，研究人員發(fā)現(xiàn)H2、H4和E3等抗體的VH和VL鏈的CDR序列高度同源。隨后，他們鑒定出15條獨(dú)特單抗序列，并選取其中熒光信號(hào)強(qiáng)且序列差異大的5株抗體C4、F2、F3、F6和G7用于重組表達(dá)和純化。

Omp38特異性單抗的抗原交叉活性分析
之前的研究發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動(dòng)桿菌的外膜蛋白Omp38是促進(jìn)細(xì)胞黏附和侵入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵因子。ELISA分析顯示，C4、F2、F3、F6和G7均能與Omp38結(jié)合，其EC₅₀值在1.032至202.5 µg/mL之間（圖2A）。不過(guò)，僅F2能夠與鮑曼不動(dòng)桿菌的高毒力菌株LAC-4結(jié)合，其EC₅₀值為1.06 µg/mL（圖2B）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2還能與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 17978和臨床分離株（Strain1-ST193和Strain2-ST205等）結(jié)合，表明其具有一定程度的廣譜結(jié)合能力（圖1）。

單克隆抗體與Omp38和鮑曼不動(dòng)桿菌多個(gè)菌株的結(jié)合能力

Omp38-mAb F2抑制細(xì)菌黏附和生物膜形成
鮑曼不動(dòng)桿菌形成的生物膜促進(jìn)細(xì)菌附著并定植在呼吸道上皮細(xì)胞表面，進(jìn)而引發(fā)其細(xì)胞內(nèi)增殖并最終導(dǎo)致宿主死亡。因此，研究人員接下來(lái)分析了F2對(duì)細(xì)菌致病性的影響。與同型對(duì)照相比，F(xiàn)2對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的黏附和生物膜形成均具有抑制作用（圖3）。100 µg/mL F2處理使附著在A549上皮細(xì)胞的鮑曼不動(dòng)桿菌的CFU對(duì)數(shù)值從7.56降至6.65（降低12%）。此外，在不同濃度下，F(xiàn)2對(duì)ATCC 17978的生物膜形成均有抑制作用。當(dāng)F2濃度為400 µg/mL時(shí)，抑制率達(dá)42.9%。

mAb F2抑制細(xì)菌黏附和生物膜形成

Omp38-mAb F2結(jié)合構(gòu)象分析
基于Alphafold3和GeoBiologics的預(yù)測(cè)顯示，mAb F2與Omp38胞外區(qū)的四個(gè)loop結(jié)構(gòu)結(jié)合（圖4）。根據(jù)Omp38 loop結(jié)構(gòu)的不同，研究人員將9個(gè)菌株分為四組，并基于同源建模構(gòu)建了四種結(jié)合構(gòu)象。相互作用能計(jì)算分析顯示，mAb F2與Group1（strain3）的結(jié)合親和力最強(qiáng)，其次是Group4（strain8），與ELISA分析的結(jié)果一致。

通過(guò)對(duì)比四種結(jié)合構(gòu)象，他們發(fā)現(xiàn)Omp38的每個(gè)loop結(jié)構(gòu)都包含多個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基，其側(cè)鏈參與了抗原與mAb F2之間的氫鍵形成（圖4）。在這四種構(gòu)象中，部分關(guān)鍵殘基高度保守（如loop1中的37Q）。盡管不同菌株的其他關(guān)鍵殘基存在差異，但它們?nèi)詾榭贵w結(jié)合提供了必要的氫鍵。這種保守性或許解釋了F2的廣譜結(jié)合能力。

mAb F2與鮑曼不動(dòng)桿菌之間的預(yù)測(cè)相互作用

Omp38-mAb F2的體內(nèi)保護(hù)效果
為了評(píng)估全人源mAb F2對(duì)高毒力菌株LAC-4的保護(hù)效力，研究人員將致死劑量的LAC-4經(jīng)氣管接種到小鼠體內(nèi)，隨后注射Omp38特異性單抗，并在感染后72小時(shí)監(jiān)測(cè)存活率。結(jié)果顯示，mAb F2在致死感染小鼠模型中未表現(xiàn)出保護(hù)作用。他們推測(cè)，人源化抗體的Fc片段可能與小鼠FcγR存在不相容性。后續(xù)可采用恒河猴等大型哺乳動(dòng)物模型，以便更準(zhǔn)確評(píng)估全人源單克隆抗體的治療效果。此外，LAC-4菌株的厚莢膜也許導(dǎo)致mAb F2無(wú)法接觸Omp38。

結(jié)論
在本研究中，研究團(tuán)隊(duì)采用賽業(yè)生物HUGO-Ab全人源抗體小鼠進(jìn)行免疫，并依托高通量單細(xì)胞篩選平臺(tái)，在一個(gè)月內(nèi)成功篩選出25株靶向鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白的單克隆抗體。值得注意的是，其中一株命名為F2的抗體表現(xiàn)出高效且廣譜的結(jié)合活性，不僅能強(qiáng)力結(jié)合多種鮑曼不動(dòng)桿菌菌株，還可抑制細(xì)菌附著與生物膜形成。研究人員認(rèn)為，對(duì)F2的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)有望提供新的治療方案，最終促進(jìn)人們?cè)谂R床環(huán)境中更有效地管理和控制鮑曼不動(dòng)桿菌感染。

原文檢索
Zhang, Y., Yu, W., Yu, P. et al. High-throughput single-cell analysis reveals fully human Omp38-specific monoclonal antibodies against Acinetobacter baumannii. BMC Microbiol 25, 523 (2025). https://doi.org/10.1186/s12866-025-04283-y