抑制瘢痕形成的有效靶點(diǎn)FBXL12的發(fā)現(xiàn)助力脊髓損傷后無(wú)瘢痕修復(fù)

脊髓損傷（SCI）對(duì)患者來(lái)說(shuō)是一種毀滅性打擊，會(huì)立即影響患者的感知、運(yùn)動(dòng)和自主神經(jīng)功能。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生能力有限，這些患者可能面臨終身殘疾。神經(jīng)再生的最大難題在于，損傷后的病理微環(huán)境會(huì)改變多種細(xì)胞的發(fā)育，并觸發(fā)瘢痕形成，進(jìn)而阻止受損軸突在損傷部位再生。

作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)長(zhǎng)期駐留的免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞在微環(huán)境調(diào)控和瘢痕形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。之前的研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞在瘢痕清除中起作用，為受損脊髓的修復(fù)和再生提供了潛在途徑。不過(guò)，目前尚無(wú)有效策略來(lái)靶向成人脊髓中的小膠質(zhì)細(xì)胞，因此缺乏治療手段來(lái)抑制SCI患者的瘢痕形成。

同濟(jì)大學(xué)程黎明教授、高紹榮教授、朱融融教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)近日通過(guò)多組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)FBXL12是抑制瘢痕形成的有效靶點(diǎn)。過(guò)表達(dá)FBXL12的小膠質(zhì)細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)無(wú)瘢痕愈合，再生軸突可穿過(guò)損傷中心并向下生長(zhǎng)超過(guò)2.4 mm，顯著改善運(yùn)動(dòng)功能。這項(xiàng)成果于8月20日發(fā)表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》雜志上，為SCI患者的恢復(fù)提供了新的分子靶點(diǎn)和干預(yù)策略。

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員建立了基于壓迫性損傷的小鼠SCI模型，并開(kāi)展了RNA-seq、基于LC-MS的mRNA修飾分析和表觀轉(zhuǎn)錄組芯片分析。在體外實(shí)驗(yàn)中，他們使用了敲除Fbxl12、及由FBXL12和FBXL12-T128A過(guò)表達(dá)的慢病毒載體構(gòu)建Fbxl12WT-OE和Fbxl12MUT-OE的SIM-A9小膠質(zhì)細(xì)胞系（由賽業(yè)生物提供），進(jìn)行了細(xì)胞功能、細(xì)胞形態(tài)及轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，在損傷后7天向小鼠體內(nèi)注射AAV-FBXL12（由賽業(yè)生物提供），并檢測(cè)瘢痕標(biāo)志物和軸突標(biāo)志物以及評(píng)估神經(jīng)傳導(dǎo)和小鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能。

技術(shù)路線

通過(guò)多組學(xué)分析確定m6A是SCI前后主要的修飾形式，而Fbxl12是主要修飾靶點(diǎn)
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體外分析顯示FBXL12調(diào)控細(xì)胞骨架重組并促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移
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AAV-FBXL12治療可減少脊髓損傷后的瘢痕形成并促進(jìn)小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)
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機(jī)制分析表明FBXL12-MYH14-K63泛素化是小膠質(zhì)細(xì)胞骨架重組的關(guān)鍵通路

研究結(jié)果
Fbxl12的m6A甲基化是潛在的SCI調(diào)控因子
N6-甲基腺苷（m6A）是最常見(jiàn)的mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾，介導(dǎo)多個(gè)mRNA代謝過(guò)程。之前的研究發(fā)現(xiàn)，m6A信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的軸突再生至關(guān)重要。于是，研究人員建立了基于壓迫性損傷的小鼠SCI模型，并對(duì)受損脊髓組織進(jìn)行了RNA-seq、基于LC-MS的mRNA修飾分析和表觀轉(zhuǎn)錄組芯片分析。研究結(jié)果表明，m6A是SCI前后主要的修飾形式（圖1），且m6A整體水平在SCI的急性期顯著升高。

通過(guò)整合轉(zhuǎn)錄組和表觀轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，他們鑒定出4個(gè)關(guān)鍵m6A靶基因，其中Fbxl12（編碼SCF型E3泛素連接酶復(fù)合物的底物識(shí)別組分）是變化最顯著的基因。與對(duì)照組相比，F(xiàn)bxl12的mRNA表達(dá)和m6A水平在SCI后顯著升高。免疫印跡和qPCR分析也證實(shí)了Fbxl12表達(dá)在SCI進(jìn)展過(guò)程中上調(diào)（圖1）。這些轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)表明m6A修飾與Fbxl12之間存在功能性關(guān)聯(lián)，這些關(guān)聯(lián)與SCI進(jìn)展的調(diào)控相關(guān)。

圖1. Fbxl12的m6A甲基化可能調(diào)控著SCI進(jìn)展過(guò)程

為了進(jìn)一步驗(yàn)證SCI后表達(dá)Fbxl12的主要細(xì)胞類型，研究人員分別使用細(xì)胞類型特異性標(biāo)記物NeuN、IBA1、GFAP 和 OLIG2 對(duì)神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了免疫共染色。脊髓損傷組織的免疫共染色結(jié)果顯示，在損傷部位近端（300 μm區(qū)域），95%的激活小膠質(zhì)細(xì)胞呈FBXL12陽(yáng)性，而在損傷部位遠(yuǎn)端，僅有9.5%的靜息小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)FBXL12。在體外實(shí)驗(yàn)中，用髓鞘堿性蛋白（MBP）處理小膠質(zhì)細(xì)胞可上調(diào)Fbxl12的表達(dá)，并顯著提高Fbxl12 mRNA中的m6A水平。這些結(jié)果表明，m6A修飾可能促進(jìn)了FBXL12蛋白的翻譯。

后續(xù)的分析發(fā)現(xiàn)，敲降m6A “writer”（METTL3/METTL14）或“reader”（YTHDF1）可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中FBXL12的翻譯。使用AAV-Mettl3敲除小鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中的Mettl3后，F(xiàn)bxl12表達(dá)顯著下降，且沒(méi)有改變損傷部位周圍小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量。這些數(shù)據(jù)表明，m6A修飾促進(jìn)了激活小膠質(zhì)細(xì)胞中FBXL12的翻譯。

圖2. m6A促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞中FBXL12的合成

FBXL12調(diào)控細(xì)胞骨架重組并促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移
接下來(lái)，研究人員深入探究了FBXL12在小膠質(zhì)細(xì)胞中的功能。他們使用慢病毒載體（由賽業(yè)生物提供）在SIM-A9小膠質(zhì)細(xì)胞中對(duì)FBXL12基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)、突變。結(jié)果顯示，F(xiàn)BXL12過(guò)表達(dá)可顯著增強(qiáng)SIM-A9小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移能力，而FBXL12缺失則顯著抑制遷移。這一結(jié)果在經(jīng)AAV編輯的出生后第2天小鼠的原代小膠質(zhì)細(xì)胞中得到了驗(yàn)證。通過(guò)掃描電鏡觀察由FBXL12過(guò)表達(dá)和敲除引起的小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)改變，圖像顯示，F(xiàn)bxl12過(guò)表達(dá)的小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)立體飽滿的形態(tài)，絲狀偽足數(shù)量顯著增加；而Fbxl12敲除細(xì)胞則明顯扁平化。同時(shí)檢查了FBXL12 過(guò)表達(dá)和敲除對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖及吞噬能力的影響。綜上，這些結(jié)果表明FBXL12調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組并促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移，但抑制其增殖。

作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的駐留免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞承擔(dān)著監(jiān)控微環(huán)境的職責(zé)。為此，研究人員進(jìn)一步探究了Fbxl12對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞趨化功能的影響。結(jié)果顯示，F(xiàn)bxl12過(guò)表達(dá)導(dǎo)致炎癥和纖維化相關(guān)的趨化因子（如CCL2、CCL3和CCL4）下調(diào)，而穩(wěn)態(tài)相關(guān)的趨化因子（如CCL19、CXCL11和CXCL13）上調(diào)。對(duì)野生型和過(guò)表達(dá)Fbxl12的小膠質(zhì)細(xì)胞的RNA-seq分析證實(shí)了Fbxl12對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移和趨化因子分泌的調(diào)控作用。

圖3. FBXL12調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組，促進(jìn)遷移，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫反應(yīng)。

AAV-FBXL12治療可減少瘢痕形成并促進(jìn)功能恢復(fù)
之后，研究人員在脊髓損傷后第7天將AAV-FBXL12（由賽業(yè)生物提供）以鞘內(nèi)注射方式注射至損傷部位附近的脊髓區(qū)域。他們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXL12的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的均勻分布，并誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞向損傷部位遷移。此外，小膠質(zhì)細(xì)胞的衰老狀態(tài)對(duì)其神經(jīng)修復(fù)功能有重要影響。損傷后28天脊髓切片免疫熒光染色顯示，AAV-FBXL12遞送改變了FABP5的表達(dá)，并抑制了損傷部位周圍IFITM3的表達(dá)，使小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)無(wú)瘢痕傷口愈合的特征。

經(jīng)AAV-FBXL12治療后，研究人員發(fā)現(xiàn)瘢痕區(qū)域顯著縮小，損傷后28天和56天分別減少58.9%和58.6%。同時(shí)，SCI后損傷部位的GFAP缺失區(qū)域和COL3A1表達(dá)也顯著下降，表明瘢痕形成減少。這些數(shù)據(jù)表明在脊髓損傷后第7天注射AAV-FBXL12可實(shí)現(xiàn)無(wú)瘢痕愈合。

他們下一步探討了FBXL12誘導(dǎo)的無(wú)瘢痕修復(fù)是否能促進(jìn)軸突再生。發(fā)現(xiàn)AAV-FBXL12遞送導(dǎo)致?lián)p傷后28天有更多的軸突穿過(guò)損傷中心，損傷后56天檢測(cè)到超過(guò)2.4 mm軸突再生。電生理學(xué)分析顯示，AAV-FBXL12遞送后電生理信號(hào)振幅顯著增大，潛伏期顯著縮短，表明信號(hào)傳導(dǎo)在一定程度上得到恢復(fù)。損傷后49天，部分小鼠出現(xiàn)后肢背側(cè)邁步。這些數(shù)據(jù)證實(shí)AAV-FBXL12可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生以及損傷脊髓的功能重建。

圖4. FBXL12注射可減少小鼠的瘢痕形成，并促進(jìn)軸突再生

FBXL12通過(guò)MYH14 K63泛素化調(diào)控細(xì)胞骨架重組
為了闡明FBXL12介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移的分子機(jī)制，研究人員采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)比較了小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)MBP刺激后的FBXL12結(jié)合蛋白（FBP）圖譜，發(fā)現(xiàn)肌球蛋白是激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中FBXL12的底物。免疫共沉淀分析表明，F(xiàn)BXL12通過(guò)K63連接泛素化修飾增強(qiáng)肌球蛋白重鏈14（MYH14）的穩(wěn)定性。MYH14與F-肌動(dòng)蛋白共定位。敲降MYH14可有效阻斷FBXL12介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞遷移和絲狀偽足形成，證實(shí)FBXL12-MYH14-K63泛素化是小膠質(zhì)細(xì)胞骨架重組的關(guān)鍵通路。

結(jié)論

圖5. FBXL12抑制瘢痕形成并促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)

總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，m6A-FBXL12-MYH14軸是激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中一種新型的細(xì)胞骨架重組通路（圖3）。研究人員發(fā)現(xiàn)，在脊髓損傷后第7天針對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞中的FBXL12進(jìn)行靶向干預(yù)，可以提供一種有效減少瘢痕形成的新方法，并促進(jìn)軸突在損傷中心區(qū)域的再生。基于這種無(wú)瘢痕愈合及微環(huán)境改善，未來(lái)結(jié)合神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或其他臨床手段進(jìn)行聯(lián)合干預(yù)，有望在脊髓損傷后最大程度恢復(fù)患者的神經(jīng)功能。

原文檢索
Xu, X., Gao, F., Chen, Q. et al. F-box/LRR-repeat protein 12 reorchestrated microglia to inhibit scarring and achieve adult spinal cord injury repair. Sig Transduct Target Ther 10, 259 (2025). https://doi.org/10.1038/s41392-025-02354-0