人類神經(jīng)發(fā)育障礙小型豬模型的建立及轉(zhuǎn)錄組分析研究

人類神經(jīng)發(fā)育障礙（neurodevelopmental disorders，NDDs），如自閉癥譜系障礙（Autism spectrum disorders，ASD）和智力障礙（Intellectual disability，ID）¹，是致殘率最高的兒童精神疾病，被認(rèn)為是多基因遺傳因素和外界環(huán)境因素共同作用引起的疾病，但其具體發(fā)病機(jī)制尚有諸多不明^2,3。目前NDD發(fā)病機(jī)制研究多基于嚙齒類動物模型，而由于腦結(jié)構(gòu)和基因同源性的差異，這些動物模型不能完全模擬NDD的重要臨床特征⁴。因此建立與人在結(jié)構(gòu)和生理上更相似的大動物模型對探明NDD發(fā)病機(jī)制和篩選靶點(diǎn)藥物有重要價值⁵。

2024年6月28日，云南大學(xué)生物醫(yī)藥研究院程郢教授聯(lián)合云南農(nóng)業(yè)大學(xué)魏紅江教授、趙紅業(yè)教授在Cell and Bioscience雜志發(fā)表了題為“Generation and transcriptomic characterization of MIR137 knockout miniature pig model for neurodevelopmental disorders”的研究論文，在小型豬模型中證明了MIR137缺失對神經(jīng)發(fā)育及相關(guān)疾病的影響，明確了小型豬可作為神經(jīng)發(fā)育障礙的新型動物模型，為其在人類神經(jīng)發(fā)育障礙疾病研究中的潛在應(yīng)用提供理論依據(jù)。

研究材料：
在本研究中，研究人員利用云南特色實驗動物“滇南小耳豬”成功建立了精神疾病風(fēng)險基因MIR137敲除的小型豬模型，并同時使用了小鼠模型及hiPSC及誘導(dǎo)細(xì)胞系模型（其中hiPSC細(xì)胞系由賽業(yè)生物提供）。

技術(shù)方法：
在研究中采用了多項技術(shù)，包括基于CRISPR/ Cas9的基因編輯技術(shù)、體細(xì)胞核移植技術(shù)、無PCR全基因組測序技術(shù)及分析、Western blotting、hiPSC的誘導(dǎo)分化、免疫熒光、轉(zhuǎn)錄組測序及分析等。

技術(shù)路線如圖所示：

研究結(jié)果
首先，研究人員利用云南特色實驗動物“滇南小耳豬”，通過CRISPR/Cas9和體細(xì)胞核移植技術(shù)成功地獲得了精神疾病風(fēng)險基因MIR137敲除（MIR137^–/–）的小型豬模型，利用無PCR全基因組測序技術(shù)（PCR-free whole genome sequencing,WGS）驗證了基于CRISPR/ Cas9的MIR137基因編輯缺失效率，并從分子水平驗證了小型豬模型中miR-137的缺失。

圖 1 MIR137基因敲除（MIR137^–/–）小型豬的構(gòu)建。A MIR137^–/–小型豬模型的構(gòu)建實驗流程。PFF：豬胎兒成纖維細(xì)胞。B 豬MIR137基因中sgRNA靶向位點(diǎn)示意圖。C 通過體細(xì)胞核移植（SCNT）技術(shù)移植的MIR137^–/– 小型豬模型的胚胎數(shù)據(jù)匯總。D 新生MIR137^–/–仔豬的代表性圖片。E MIR137^–/–小型豬的PCR基因分型結(jié)果。F 無PCR全基因組測序（WGS）的基因組覆蓋度。G 無PCR全基因組測序分析顯示基因組中MIR137存在74 bp的缺失。H MIR137^–/–小型豬與野生型（WT）對照小型豬中成熟miR-137表達(dá)水平的定量RT-PCR分析。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，統(tǒng)計學(xué)顯著性采用雙尾t檢驗，****p < 0.0001.

野生型（wild-type, WT）對照小型豬與MIR137^–/–小型豬模型大腦皮層的轉(zhuǎn)錄組分析顯示出由于miR-137缺失造成的基因表達(dá)顯著差異�；�因本體論（Gene Ontology, GO）分析顯示這些差異表達(dá)基因（differentially expressed genes, DEGs）在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、細(xì)胞定位和突觸信號傳導(dǎo)相關(guān)的生物進(jìn)程中顯著富集，通路分析顯示DEGs在神經(jīng)元系統(tǒng)發(fā)育、化學(xué)突觸傳遞和軸突引導(dǎo)等通路顯著富集中。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與疾病關(guān)聯(lián)性分析顯示，MIR137^–/–小型豬大腦中DEGs中包括大量與ID和癲癇相關(guān)的基因，與人類ASD病人腦組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)高度一致，表明在小型豬腦中miR-137的缺失會導(dǎo)致與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的基因失調(diào)，而這些基因的失調(diào)可能是NDD的發(fā)病機(jī)制。

圖 2 MIR137缺失導(dǎo)致小型豬大腦出現(xiàn)顯著轉(zhuǎn)錄組變化。A RNA測序?qū)嶒灹鞒�。B 野生型（WT，n=3）與MIR137^–/–（n=2）小型豬的主成分分析。C 差異表達(dá)基因（DEGs）火山圖。在MIR137^–/–小型豬大腦中共鑒定出2117個上調(diào)基因和1903個下調(diào)基因（閾值標(biāo)準(zhǔn)：log2倍數(shù)變化>1或<-1，且校正后p值<0.05）。D-F MIR137^–/–小型豬大腦中DEGs的TOP5基因本體（GO）（D）、富集通路（E）及疾病關(guān)聯(lián)（F）分析。G 熱圖顯示MIR137^–/–小型豬大腦DEGs與三個不同ASD患者腦組織數(shù)據(jù)集中DEGs的重疊基因表達(dá)模式。

為了評估小型豬模型是否能更準(zhǔn)確地表現(xiàn)人類NDD的發(fā)病機(jī)制，研究人員進(jìn)一步構(gòu)建并使用MIR137缺失的人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）分化而來的前腦神經(jīng)元（hiPSC-derived neuron）進(jìn)行了跨物種比較分析。結(jié)果顯示，相較于MIR137^–/–小鼠，MIR137^–/–小型豬展現(xiàn)出更多與MIR137^–/– hiPSC-derived neuron的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果更一致的關(guān)鍵神經(jīng)元基因、ASD和ID風(fēng)險基因的變化，表明MIR137^–/–小型豬模型可能更好地反映了人類新生兒階段miR-137缺失導(dǎo)致的關(guān)鍵神經(jīng)元基因變化，并在分子水平上可作為可靠的人類NDD疾病機(jī)制研究模型。

圖 3 小鼠、豬及hiPSC來源神經(jīng)元模型中miR-137缺失的比較分析。A MIR137基因敲除小鼠的構(gòu)建。通過同源重組設(shè)計載體靶向小鼠胚胎干細(xì)胞中的MIR137基因，在MIR137基因上游（約2 kb）和下游（約0.6 kb）插入兩個loxP位點(diǎn)（上圖）。與Zp3-Cre小鼠交配后實現(xiàn)生殖細(xì)胞特異性Mir137缺失，自交獲得純合Mir137敲除（Mir137^–/–）小鼠（下圖）。B MIR137敲除hiPSC來源前腦神經(jīng)元的構(gòu)建。設(shè)計特異性sgRNA靶向人類MIR137基因，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)通過電轉(zhuǎn)將Cas9/sgRNA導(dǎo)入hiPSC。篩選獲得CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的MIR137缺失單克隆細(xì)胞（MIR137^–/–），并誘導(dǎo)分化為神經(jīng)前體細(xì)胞（NPCs）和前腦神經(jīng)元。C qPCR驗證MIR137^–/– hiPSC來源NPCs和前腦神經(jīng)元中成熟miR-137表達(dá)降低。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，統(tǒng)計學(xué)顯著性采用非配對t檢驗，*p < 0.001，**p < 0.0001。D 豬、小鼠及hiPSC來源前腦神經(jīng)元中DEGs的數(shù)量及占比。使用Ensembl Biomart將小鼠和豬基因符號轉(zhuǎn)換為人類基因符號進(jìn)行跨物種比較，無法轉(zhuǎn)換的基因被排除分析。E-F Mir137^–/–小鼠腦組織（E）與MIR137^–/– hiPSC來源前腦神經(jīng)元（F）中DEGs的TOP5基因本體條目、富集通路及疾病關(guān)聯(lián)分析。G 跨物種神經(jīng)元標(biāo)志基因表達(dá)熱圖。與MIR137^–/–小型豬DEGs重疊的神經(jīng)元標(biāo)志基因，數(shù)據(jù)來源于公共數(shù)據(jù)庫（http://xteam.xbio.top/CellMarker/）。H UpSet圖展示小型豬、小鼠、hiPSC來源前腦神經(jīng)元DEGs與ASD、ID及精神分裂癥（SCZ）相關(guān)基因的交集關(guān)系。

研究人員進(jìn)一步對MIR137^–/–小型豬模型中人類特異性miR-137靶標(biāo)鑒定的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在83個顯著富集的上調(diào)基因中，有8個基因被報道為ASD 風(fēng)險基因，以及7種基因與ID發(fā)生相關(guān)。鑒于miR-137在ASD中的潛在作用，研究人員構(gòu)建了一個預(yù)測的ASD基因網(wǎng)絡(luò)，并發(fā)現(xiàn)在上調(diào)的miR-137靶基因中，尤其CAMK2A和CACNA1H兩種基因，可能會影響與ASD和ID相關(guān)的鄰近基因的表達(dá)，包括CAMK2B、GRIN1和CACNA1G。其中，CAMK2A作為一個關(guān)乎大腦學(xué)習(xí)、記憶、突觸可塑性和神經(jīng)元信號等功能的關(guān)鍵基因，僅在MIR137^–/–小型豬模型中發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào)，而在MIR137^–/–小鼠模型中未檢測到差異表達(dá)。

圖 4 MIR137^–/–小型豬中人類特異性miR-137靶基因的鑒定。A 在MIR137^–/–小型豬中上調(diào)的DEGs顯著富集于人類miR-137靶基因(從TargetScanHuman 8.0獲取的1314個基因)。其中8個基因與ASD相關(guān)，7個基因與ID相關(guān)。B 通過qPCR驗證MIR137^–/–小型豬模型中篩選出的人類miR-137靶基因表達(dá)情況。C miR-137介導(dǎo)的ASD風(fēng)險基因互作網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。構(gòu)建了一個預(yù)測的ASD基因網(wǎng)絡(luò)，探索了ASD風(fēng)險基因之間的大腦特異性相互作用，包括在MIR137^–/–小型豬腦部選定的上調(diào)miR-137靶基因(粗線標(biāo)記的點(diǎn))。上調(diào)的miR-137預(yù)測靶基因可能影響鄰近ASD候選基因的表達(dá)，如先前報道與ASD和ID相關(guān)的CAMK2B、GRIN1和CACNA1G。D 預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)843個基因同時是人類和小鼠miR-137的靶標(biāo)。E 在MIR137^–/–小型豬中上調(diào)的21個DEGs是人類特異性的miR-137靶基因。

結(jié)果分析顯示，MIR137^–/–小型豬大腦中DEGs與神經(jīng)發(fā)育和突觸形成相關(guān)。疾病關(guān)聯(lián)性分析顯示，這些DEGs中包括大量與ID和癲癇相關(guān)的基因，與人類ASD病人腦組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)高度一致，而在小鼠模型中卻從未發(fā)現(xiàn)�？缥锓N比較分析顯示，與MIR137^–/–小鼠相比，MIR137^–/–小型豬展現(xiàn)出更多關(guān)鍵神經(jīng)元基因、ASD和ID風(fēng)險基因的變化，這與MIR137^–/– hiPSC-derived neuron的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果更一致性。并且在MIR137^–/–小型豬大腦中，與認(rèn)知損傷和NDD相關(guān)的CAMK2A等人類特異性miR-137靶基因顯著上調(diào)。這些結(jié)果表明，小型豬中miR-137的缺失影響了神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，可能促進(jìn)了NDD的發(fā)生發(fā)展。遺憾的是，純合敲除的MIR137^–/–小型豬模型出生后致死，未來研究人員將嘗試?yán)�用單sgRNA和dCAS9/CRISPR系統(tǒng)獲取雜合的MIR137^+/–小型豬模型，并綜合評估其在與NDD核心臨床癥狀相關(guān)的行為分析中的表現(xiàn)。

綜上所述，本研究在小型豬模型中證明了MIR137缺失對神經(jīng)發(fā)育及相關(guān)疾病的影響，明確了小型豬可作為神經(jīng)發(fā)育障礙的新型動物模型，為其在人類神經(jīng)發(fā)育障礙疾病研究中的潛在應(yīng)用提供理論依據(jù)。

原文鏈接：DOI：10.1186/s13578-024-01268-8
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