Pld4-KO小鼠助力證實(shí)人類(lèi)PLD4缺陷可導(dǎo)致SLE并闡明其致病機(jī)制

2025年9月10日，由良渚實(shí)驗(yàn)室、東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院國(guó)家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心和浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院等單位合作完成的題為“Loss-of-function mutations in PLD4 lead to systemic lupus erythematosus”的研究論文在《Nature》發(fā)表。該研究首次證實(shí)人類(lèi)PLD4缺陷可導(dǎo)致SLE并闡明了其致病機(jī)制，為SLE的精準(zhǔn)診療提供了重要理論依據(jù)。

南模生物為該研究提供了Pld4-KO（目錄號(hào)：NM-KO-200682）小鼠。
 

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種臨床表現(xiàn)異質(zhì)性高、多系統(tǒng)受累的自身免疫性疾病，患者常伴有特異性自身抗體陽(yáng)性及補(bǔ)體激活。SLE確切發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，遺傳因素與免疫異常在其發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。單基因狼瘡是自身免疫性疾病的一個(gè)亞型，由單基因突變引起，包含一系列具有狼瘡樣表型的疾病，目前已發(fā)現(xiàn)SLE的致病基因有30余個(gè)。

細(xì)胞內(nèi)核酸感知通路在抵御外來(lái)病原體、修復(fù)組織損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。定位于內(nèi)體中的Toll樣受體7（TLR7）和9（TLR9）是感知RNA和DNA的核心分子，對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病至關(guān)重要。在漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞（pDCs）中，TLR7和TLR9通路的激活會(huì)促使細(xì)胞釋放大量干擾素，進(jìn)而促進(jìn)自身抗原提呈和炎癥反應(yīng)發(fā)生；在B細(xì)胞中，這兩條通路的激活則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量抗核酸自身抗體，推動(dòng)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)展。

磷脂酶D家族成員4（phospholipase D family member 4，PLD4）在樹(shù)突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和B細(xì)胞中高表達(dá)。其作為一種定位于內(nèi)溶酶體的5’核酸外切酶，能切割單鏈RNA（ssRNA）和單鏈DNA（ssDNA），進(jìn)而限制TLR7和TLR9的過(guò)度激活。

已有研究表明，Pld4基因敲除小鼠會(huì)出現(xiàn)一系列自身免疫表型，包括體重減輕、脾臟腫大、自身抗體增加和免疫復(fù)合物沉積。此外，同時(shí)缺失Pld4及其家族成員Pld3的小鼠會(huì)在幼年期死亡。盡管Pld4缺陷小鼠會(huì)出現(xiàn)自身免疫表型，但PLD4基因突變導(dǎo)致的人類(lèi)疾病尚未見(jiàn)報(bào)道。
 

圖1. Pld4突變小鼠表現(xiàn)出顯著的脾腫大、淋巴結(jié)病變及體重降低（Ann Rheum Dis. 2019;78(4):509-518）

那人類(lèi)中PLD4是否致病SLE？具體機(jī)制是什么？以及是否具有靶向治療意義？

為明確這些問(wèn)題，研究人員進(jìn)行了以下研究：

在SLE患者中發(fā)現(xiàn)PLD4變異
五名患者均確診為系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE），且全部表現(xiàn)為腎臟受累，腎活檢提示增殖性狼瘡腎炎（圖1a）。所有患者均出現(xiàn)白細(xì)胞減少、貧血和血小板減少等血液系統(tǒng)異常。其中四人出現(xiàn)皮疹（如蕁麻疹、顴部紅斑或斑片狀皮疹），三人有關(guān)節(jié)痛/關(guān)節(jié)炎及漿膜炎（附表1）。所有患者抗核抗體（ANA）均為陽(yáng)性并伴有低補(bǔ)體血癥。全外顯子組測(cè)序結(jié)果表明，所有患者均攜帶PLD4基因的雙等位基因突變（圖1b）。這些突變均位于PLD4的催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)，并被預(yù)測(cè)為有害變異（圖1c）。雖然這些突變?cè)诳臻g上并不聚集于單一結(jié)構(gòu)域，但結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明它們可能通過(guò)影響氫鍵形成或底物結(jié)合等不同機(jī)制，進(jìn)而損害外切酶活性。
 

圖2. 5名SLE患者雙等位基因PLD4變異的鑒定

PLD4突變顯著激活DCs細(xì)胞功能

為全面評(píng)估患者的炎癥水平，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)患者P1、P2及健康對(duì)照的外周血單核細(xì)胞（PBMCs）進(jìn)行了RNA-seq。GSEA分析顯示，IFNα反應(yīng)、IFNγ反應(yīng)以及通過(guò)NF-κB介導(dǎo)的TNF信號(hào)通路是最顯著富集的通路（圖2a）。熱圖及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，I型干擾素通路相關(guān)基因及STAT1磷酸化水平均顯著上調(diào)（圖2b, 2c）。

進(jìn)一步單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）揭示，I型干擾素通路相關(guān)基因（如IFIT2、OAS2等）的高表達(dá)主要集中在表達(dá)PLD4的樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）和單核細(xì)胞中；同時(shí)，這些細(xì)胞中TLR7/9及其信號(hào)分子（TRAF6、IRAK1、IRAK4）的表達(dá)也顯著升高（圖2d-f）。質(zhì)譜流式檢測(cè)技術(shù)（CyTOF）結(jié)果表明，患者P2的外周血單核細(xì)胞（PBMCs）中IFNα、IFNγ、TNF、IL-1β、CXCL2、CCL4、IL-23和GM-CSF水平顯著升高，其中DCs的指標(biāo)尤為突出（圖2g）。以上結(jié)果提示PLD4缺陷可能通過(guò)影響DCs細(xì)胞功能引發(fā)患者系統(tǒng)性炎癥和自身免疫反應(yīng)。
 

圖3. 患者DC中TLR 信號(hào)傳導(dǎo)和I型干擾素通路的異常激活

PLD4基因突變激活關(guān)鍵免疫炎癥信號(hào)通路

為明確上述突變對(duì)PLD4功能的影響，研究團(tuán)隊(duì)利用純化的野生型和PLD4突變蛋白來(lái)評(píng)估其單鏈核酸外切酶活性。結(jié)果表明，這些錯(cuò)義突變（Pro181Leu、Asp189Glu、Arg201Gln、Tyr248Cys、Ala323Val和Gly457Asp）會(huì)顯著降低PLD4的外切酶活性（圖3a）。通過(guò)在HEK293T過(guò)表達(dá)突變PLD4后進(jìn)行核酸外切酶活性檢測(cè)，結(jié)果與上述一致，所有突變型PLD4組中的單鏈DNA均未被切割（圖3b）。此外，研究團(tuán)隊(duì)也對(duì)患者P1和健康對(duì)照組外周血單核細(xì)胞（PBMCs）中內(nèi)源性PLD4的核酸外切酶活性進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果顯示，在進(jìn)行核酸外切酶活性檢測(cè)的1、2和4小時(shí)后，患者P1的殘留底物量隨時(shí)間推移持續(xù)增加，這表明患者P1體內(nèi)內(nèi)源性PLD4的核酸外切酶活性存在缺陷（圖3c)。

對(duì)患者P1和P2的PBMCs進(jìn)行RNA測(cè)序分析，結(jié)果顯示，無(wú)論是基礎(chǔ)水平還是CpG-DNA刺激后，與健康對(duì)照組相比，患者體內(nèi)I型干擾素通路基因表達(dá)水平均顯著升高（圖3d)。（知識(shí)小課堂：CpG-DNA是一類(lèi)以CpG二核苷酸為核心的未甲基化的特殊DNA序列，可以激活免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子。CpG-DNA能通過(guò)TLR9直接活化 B 細(xì)胞，誘導(dǎo)其增殖并抑制其凋亡。此外，CpG-DNA還能促進(jìn)免疫球蛋白和IL-6、IL-10 和 IL-12等多種細(xì)胞因子的分泌，增加MHC II類(lèi)分子和B7共刺激分子的表達(dá)，激活單核巨噬細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子和趨化因子，從而促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和誘發(fā)體液及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)）。qPCR結(jié)果證實(shí)，TNF、IFNA2、IFIT1、ISG15和RSAD2等關(guān)鍵炎癥基因的轉(zhuǎn)錄水平在患者PBMCs中也呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，且這種上調(diào)現(xiàn)象在基礎(chǔ)狀態(tài)和CpG-DNA刺激后均與健康對(duì)照組存在差異。而未攜帶PLD4突變的SLE患者經(jīng)CpG-DNA刺激后的PBMCs僅表現(xiàn)出微弱反應(yīng)（圖3e)。在PLD4-KO THP-1細(xì)胞中進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，經(jīng)CpG-DNA刺激后，與野生型細(xì)胞相比，PLD4-KO細(xì)胞中IFIT1、IFI44L和CXCL3的表達(dá)量增顯著加（圖3f)。以上結(jié)果提示，研究結(jié)果表明TLR7/9通路是PLD4功能缺失調(diào)控的關(guān)鍵信號(hào)通路。
 

圖4. 突變對(duì)PLD4核酸外切酶活性的影響

既往研究表明，在Pld3^-/-；Pld4^-/-雙敲除小鼠中STING依賴(lài)性信號(hào)傳導(dǎo)被激活，同時(shí)PLD3基因敲除會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體DNA在溶酶體中異常積聚并發(fā)生胞質(zhì)泄漏，從而激活cGAS-STING信號(hào)通路并引發(fā)自噬反應(yīng)。因此，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探究了STING通路在PLD4缺陷驅(qū)動(dòng)的炎癥中的作用。Western blot結(jié)果表明，PLD4-KO THP-1細(xì)胞系中STING的磷酸化和炎癥途徑增強(qiáng)；使用STING特異性抑制劑H-151²⁶處理后，可有效抑制PLD4缺失引發(fā)的I型干擾素信號(hào)通路激活（圖3g)。同時(shí)，經(jīng)H-151（STING 抑制劑）和C-176²⁶（STING 抑制劑）處理后，下游炎癥相關(guān)基因（尤其是I型干擾素相關(guān)基因，如IFIT1、IFI27、IFI44、OAS1和ISG15）顯著下調(diào)（圖3h)。以上結(jié)果提示，STING通路是PLD4功能缺失調(diào)控的另一關(guān)鍵信號(hào)通路。

Pld4-KO小鼠表現(xiàn)出人類(lèi)SLE病理特點(diǎn)

為揭示PLD4基因功能缺失性突變導(dǎo)致SLE的致病機(jī)制及其主要效應(yīng)免疫細(xì)胞群，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了Pld4基因敲除小鼠（Pld4-KO）模型。結(jié)果顯示，Pld4-KO小鼠表現(xiàn)出典型的狼瘡樣表型，包括體重減輕、脾腫大、自身抗體升高及腎臟免疫復(fù)合物等（圖4a、4b）。進(jìn)一步對(duì)腎臟進(jìn)行scRNA-seq，結(jié)果顯示，相較于野生型小鼠，Pld4-KO參與I型IFN通路的基因，如Ifi27、Isg15和Ddx58，在Pld4的免疫細(xì)胞和腎組織細(xì)胞（足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、主細(xì)胞和近端腎小管細(xì)胞）中均顯著上調(diào)（圖4c）。流式細(xì)胞術(shù)分析進(jìn)一步證實(shí)了scRNA-seq分析結(jié)果：相較于野生型小鼠，Pld4-KO小鼠的免疫細(xì)胞群呈現(xiàn)顯著擴(kuò)增（圖4d）。在SLE發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞群，包括漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞（pDCs）和漿細(xì)胞（PCs），均顯著增加（圖4e、4f）。此外，CD4+ T細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞數(shù)量顯著上升，而年齡相關(guān)的B細(xì)胞及髓系樹(shù)突狀細(xì)胞（mDCs）則保持穩(wěn)定（圖4g）。

最后，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了混合骨髓嵌合體小鼠模型（將來(lái)自WT-CD45.1-WT-CD45.2或WT-CD45.1-Pld4-KO-CD45.2 的骨髓按1:1比例混合，移植入經(jīng)致死劑量輻照的CD45.1小鼠體內(nèi)），證實(shí)pDCs和PCs的異常擴(kuò)增是PLD4基因缺陷的細(xì)胞內(nèi)在作用，從而闡明了PLD4在維持免疫穩(wěn)態(tài)中的關(guān)鍵作用（圖4h、4i）。以上結(jié)果提示，PLD4在SLE的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)影響腎炎的病理進(jìn)程。
 

圖5. Pld4-KO小鼠出現(xiàn)自身免疫表型

延伸閱讀：CD45.1/CD45.2、Thy1.1/Thy1.2、OT-1/OT-2小鼠，應(yīng)該pick誰(shuí)？
 

JAKi可挽救Pld4-KO小鼠表型

鑒于I型干擾素通路在Pld4-KO小鼠和患者體內(nèi)均顯著上調(diào)，研究團(tuán)隊(duì)推測(cè)使用JAK抑制劑（JAKi）巴瑞替尼（baricitinib，已獲批用于SLE疾病的治療）治療可能具有一定療效。為驗(yàn)證這一猜想，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)Pld4-KO小鼠進(jìn)行干預(yù)驗(yàn)證，持續(xù)灌胃給藥8周后，與未治療組相比，巴瑞替尼治療組小鼠在體重增加、抗雙鏈DNA抗體和抗雙鏈RNA抗體血漿水平、脾臟體積等方面均得到顯著改善（圖5a-c）。隨后，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)患者來(lái)源的PBMCs進(jìn)行了巴瑞替尼治療。結(jié)果顯示，該藥物顯著抑制了患者PBMC中異常升高的I型IFN通路，并對(duì)NF-κB通路產(chǎn)生部分抑制效應(yīng)（圖5f)。綜上所述，I型干擾素通路是PLD4缺陷后自身免疫和炎癥表型的關(guān)鍵調(diào)控通路。
 

圖6. 巴瑞替尼逆轉(zhuǎn)Pld4-KO小鼠的異常表型

總的來(lái)說(shuō)，本研究在5名SLE患者中鑒定出PLD4雙等位基因功能喪失突變，首次確立“PLD4缺乏病（PLDD）”這一單基因SLE亞型；功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)PLD4缺失通過(guò)擾亂內(nèi)體核酸穩(wěn)態(tài)、過(guò)度激活Ⅰ型IFN通路致病。小鼠與患者樣本均顯示JAK抑制劑baricitinib可顯著逆轉(zhuǎn)異常表型，為PLDD提供精準(zhǔn)靶向治療策略。綜上，該研究不僅拓展了對(duì)SLE遺傳背景的理解，明確了PLD4在發(fā)病中的核心作用，也為未來(lái)開(kāi)展基于基因分型的個(gè)體化治療提供了重要依據(jù)。

圖7. 研究模式圖

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