從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路開始譜系示蹤課題設(shè)計(jì)及其中各類工具應(yīng)用的全面梳理

想做細(xì)胞命運(yùn)的相關(guān)研究，但譜系示蹤的東西又繁瑣又復(fù)雜？剛開始設(shè)計(jì)課題，已經(jīng)被各類Cre/Dre工具鼠的介紹文獻(xiàn)搞暈了，這該怎么辦呢？別擔(dān)心，本篇推文從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路開始，幫您梳理譜系示蹤中各類工具的應(yīng)用。

Step 1 了解譜系示蹤是什么？
譜系示蹤，通常是指使用各種手段對(duì)某類祖細(xì)胞亞群進(jìn)行標(biāo)記，在后續(xù)時(shí)間點(diǎn)對(duì)其分化命運(yùn)進(jìn)行檢測(cè)。更通俗地說，我們需要給細(xì)胞加一個(gè)標(biāo)記，這個(gè)標(biāo)記可以伴隨它的增殖分化（在我們的觀察期內(nèi)）一直延續(xù)下去。想要滿足這個(gè)目的，我們就必須要使用Cre-loxP為代表的重組酶的標(biāo)記方式。

想了解不同的標(biāo)記方式的區(qū)別與應(yīng)用？可點(diǎn)擊下列鏈接詳細(xì)了解
【譜系示蹤系列第一期】基礎(chǔ)細(xì)胞標(biāo)記方式

Step 2 使用重組酶的標(biāo)記方式需要涉及哪些小鼠？
顧名思義，Cre-loxP系統(tǒng)分為兩個(gè)部分：Cre酶與loxP位點(diǎn)。Cre酶調(diào)控相同的loxP（以及l(fā)ox變體）位點(diǎn)進(jìn)行重組，介導(dǎo)基因發(fā)生改變。相似的重組酶系統(tǒng)有：Dre酶與Rox位點(diǎn)、FLP酶與FRT位點(diǎn)。

想了解更詳細(xì)的Cre-Loxp重組酶系統(tǒng)相關(guān)知識(shí)，可點(diǎn)擊下列鏈接詳細(xì)了解
小鼠大學(xué)問 | Cre-Lox系統(tǒng)核心原理全解析

那么在譜系示蹤中，我們?nèi)绾谓柚�這個(gè)系統(tǒng)，合理設(shè)計(jì)小鼠進(jìn)行科學(xué)研究呢？

重組酶小鼠

報(bào)告基因小鼠

Step 3 明確想標(biāo)記的細(xì)胞所需的Marker
我們想要標(biāo)記固定類型的細(xì)胞，最重要的就是了解這類細(xì)胞如何去準(zhǔn)確定位，這一步需要大量查閱文獻(xiàn)來確定。

如果我們研究的細(xì)胞群體擁有特異性的Marker，我們僅需1個(gè)Marker即可定位細(xì)胞，那我們即可進(jìn)入基礎(chǔ)模式。

標(biāo)記目標(biāo)細(xì)胞群需2個(gè)甚至以上的細(xì)胞marker（以2個(gè)為例，稱為Marker A與Marker B），并且目標(biāo)細(xì)胞群可能是A+B+，A-B+，A+B-等多種情況。

這種情況下，標(biāo)記細(xì)胞群要精確，我們的組合搭配就要有考究，需要“基礎(chǔ)款”與“高端款”相結(jié)合。

1“高端款”報(bào)告基因小鼠，搭配“基礎(chǔ)款”重組酶小鼠

當(dāng)我們選擇使用A-Cre，B-Dre（或A-CreER，B-DreER）的基礎(chǔ)款Cre小鼠后，為了滿足我們精準(zhǔn)標(biāo)記的目的，我們可以選擇以下三種“高端款”報(bào)告基因小鼠：
交叉報(bào)告基因系統(tǒng)：標(biāo)記markerA+B+雙陽性細(xì)胞，適用于雙陽性細(xì)胞類型標(biāo)記；
獨(dú)家報(bào)告基因系統(tǒng)：標(biāo)記markerA+B-細(xì)胞，有先后順序，適用于A-CreER與B-Dre單個(gè)誘導(dǎo)性重組酶標(biāo)記
嵌套報(bào)告基因系統(tǒng)：標(biāo)記markerA+B-細(xì)胞，無先后順序，適用于A-CreER與B-DreER多個(gè)誘導(dǎo)性重組酶標(biāo)記
可點(diǎn)擊鏈接了解各類系統(tǒng)詳情

2“高端款”重組酶小鼠，搭配“基礎(chǔ)款”報(bào)告基因小鼠

當(dāng)我們選擇使用LoxP-Stop-LoxP-reporter的基礎(chǔ)款報(bào)告基因小鼠時(shí)，為滿足我們的標(biāo)記需求，重組酶小鼠也可以被設(shè)計(jì)為“高端款”：
roxCre：將 rox-Stop-rox（RSR）插入 Cre編碼區(qū)，適用于雙陽性細(xì)胞類型標(biāo)記。（loxDre同理）
CrexER：將 rox 位點(diǎn)插入到 CreER的ER區(qū)的兩側(cè)，適用于雙陽性細(xì)胞類型標(biāo)記。（DrexER同理）
dCreER：將 rox 位點(diǎn)插入到 CreER 整體編碼區(qū)的兩側(cè)，適用于已知陽性&陰性marker細(xì)胞標(biāo)記。（dDreER同理）

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譜系示蹤的難點(diǎn)——基因標(biāo)記的異位表達(dá)如何避免？（下）

3雙“高端款”聯(lián)手組合
上面講述了兩種“高端款”小鼠和“基礎(chǔ)款”小鼠搭配的情況，那么“高端款”重組酶小鼠是否能搭配“高端款”報(bào)告基因小鼠呢？

以嵌套報(bào)告小鼠與loxDre小鼠聯(lián)用為例，我們使用A-CreER小鼠、B-loxDre小鼠、NR1小鼠進(jìn)行交配。理論上，該小鼠無tamoxifen誘導(dǎo)時(shí)，無細(xì)胞被標(biāo)記；在tamoxifen誘導(dǎo)后，A+細(xì)胞會(huì)被標(biāo)記為綠色，而在誘導(dǎo)以后，A+細(xì)胞中表達(dá)B的細(xì)胞才會(huì)被標(biāo)記為紅色。

通過兩種高端款的連用，在AB表達(dá)時(shí)間層面精確的標(biāo)記了目的細(xì)胞。

轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞是否發(fā)生上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)換（epithelial-mesenchymal transition, EMT）一直是腫瘤研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。前期的研究利用體外細(xì)胞培養(yǎng)以及移植的方法認(rèn)為EMT過程對(duì)于腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移具有重要的作用，但缺乏直接的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

腫瘤模型中瞬時(shí)的、可逆的EMT過程很難用單重組酶系統(tǒng)精準(zhǔn)的捕捉到。因此，周斌研究組科研人員選擇使用roxCre的相似改造思路，構(gòu)建了loxDre重組酶，并利用雙重組酶報(bào)告基因小鼠中的嵌套報(bào)告基因小鼠，嘗試捕捉瞬間的EMT畫面。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：科研人員選擇在自發(fā)性乳腺癌腫瘤模型小鼠MMTV-PyMT的背景上，利用Kit-CreER來標(biāo)記小鼠乳腺管腔上皮細(xì)胞。利用一些間充質(zhì)細(xì)胞的分子標(biāo)記（例如Vimentin和N-cadherin）作為發(fā)生EMT的Marker，構(gòu)建了基因敲入小鼠EMTgene-LSL-Dre（N-Cad-LSL-Dre和Vim-LSL-Dre）。將以上幾種重組酶小鼠與雙重組酶報(bào)告基因小鼠NR1交配獲得EMTracer系統(tǒng)來同時(shí)示蹤發(fā)生過和未發(fā)生過EMT的乳腺腫瘤細(xì)胞。

圖. EMTracer系統(tǒng)的基因重組圖解^[1]

1. Kit-CreER與報(bào)告基因NR1的LoxP發(fā)生重組，使Kit+的乳腺管腔上皮細(xì)胞被標(biāo)記上綠色熒光蛋白（ZsGreen）。
2. Kit-CreER與EMTgene-LSL-Dre的LoxP發(fā)生重組，使介于兩個(gè)LoxP之間的stop序列被切掉，當(dāng)發(fā)生上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)換后，EMTgene就會(huì)啟動(dòng)表達(dá)。
3. EMTgene后面的Dre表達(dá)出來，與報(bào)告基因NR1的Rox發(fā)生同源重組，使報(bào)告基因NR1位于兩個(gè)Rox位點(diǎn)之間的Rox-LoxP-stop-LoxP-ZsGreen-PolyA-Rox序列被切掉，使發(fā)生過EMT的細(xì)胞由之前的綠色熒光蛋白（ZsGreen）轉(zhuǎn)變成紅色熒光蛋白（tdTomato)，實(shí)現(xiàn)對(duì)EMT的監(jiān)測(cè)。

利用兩種基因（Vimentin和N-cadherin）構(gòu)建兩套EMTracer系統(tǒng)進(jìn)行對(duì)比，可以發(fā)現(xiàn)發(fā)生轉(zhuǎn)移的細(xì)胞群中，采用Vim-EMTracer系統(tǒng)系統(tǒng)標(biāo)記的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色，而采用N-cad-EMTracer系統(tǒng)系統(tǒng)標(biāo)記的細(xì)胞呈現(xiàn)紅色，說明該乳腺癌轉(zhuǎn)移發(fā)生EMT是N-Cadherin依賴性的。

圖. 基因Vimentin和N-cadherin構(gòu)建兩套EMTracer系統(tǒng)的結(jié)果圖解^[1]

成功完成以上步驟，恭喜你，你已成為譜系示蹤標(biāo)記大師了！接下來就是根據(jù)課題研究的實(shí)際情況，購買定制合適的小鼠進(jìn)行繁育。這時(shí)候，如果有現(xiàn)成的Cre鼠工具庫就是幫大忙了！

Key Step
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南模生物深耕基因修飾動(dòng)物模型行業(yè)二十余年，為快速精準(zhǔn)地選擇合適Cre工具鼠，特推出Find Cre^®數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫包含600多種自主產(chǎn)權(quán)Cre/Dre重組酶工具鼠，以小鼠組織、器官和系統(tǒng)為主線，可分為肺、肝、胃腸道、乳腺、胰腺、感覺器官、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、骨骼肌系統(tǒng)以及其他組織器官。大家若有相關(guān)需求，可以點(diǎn)擊這里進(jìn)入Find Cre^®數(shù)據(jù)庫，查詢可用的工具鼠。

Reference：
[1] Genetic Fate Mapping of Transient Cell Fate Reveals N-Cadherin Activity and Function in Tumor Metastasis Li, Yan et al.Developmental Cell, Volume 54, Issue 5, 593 - 607.e5

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上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，簡稱"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科創(chuàng)板上市高科技生物公司（股票代碼：688265），始終以編輯基因、解碼生命為己任，專注于模式生物領(lǐng)域，打造了以基因修飾動(dòng)物模型研發(fā)為核心，涵蓋多物種模型構(gòu)建、飼養(yǎng)繁育、表型分析、藥物臨床前評(píng)價(jià)等多個(gè)技術(shù)平臺(tái)，致力于為全球高校、科研院所、制藥企業(yè)等客戶提供全方位、一體化的基因修飾動(dòng)物模型產(chǎn)品解決方案。