基于全息成像的無(wú)標(biāo)記策略為三陰性乳腺癌研究提供新視角

三陰性乳腺癌（TNBC）因其高度侵襲性及缺乏有效靶向治療策略，構(gòu)成重大臨床挑戰(zhàn)。深入解析TNBC的細(xì)胞行為特征，對(duì)于開發(fā)新型療法具有重要意義。
 
2025年6月，美國(guó)密歇根大學(xué)迪爾伯恩分校研究團(tuán)隊(duì)在《Cancer Reports》期刊上發(fā)表了一項(xiàng)突破性研究成果。該研究采用瑞典Phase Holographic Imaging（PHI）公司開發(fā)的HoloMonitor M4全息活細(xì)胞成像平臺(tái)，系統(tǒng)比較了非腫瘤源性乳腺上皮細(xì)胞MCF10A與三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231在細(xì)胞形態(tài)、運(yùn)動(dòng)性及光學(xué)厚度等多個(gè)維度的差異。基于這些數(shù)據(jù)，研究進(jìn)一步結(jié)合主成分分析（PCA）和t-分布隨機(jī)鄰域嵌入（t-SNE）等高維分析方法，揭示了兩類細(xì)胞在行為模式上的根本區(qū)別，為理解癌癥進(jìn)展機(jī)制提供了新的分子視角。
 
實(shí)驗(yàn)方法
HoloMonitor M4 系統(tǒng)具備無(wú)需標(biāo)記即可實(shí)時(shí)成像的優(yōu)勢(shì)，使研究者能夠在維持細(xì)胞完整性的同時(shí)，全面分析細(xì)胞尺寸、運(yùn)動(dòng)性、形態(tài)不規(guī)則性及光學(xué)厚度等關(guān)鍵參數(shù)。該系統(tǒng)的獨(dú)特性能支持對(duì)細(xì)胞行為進(jìn)行連續(xù)延時(shí)追蹤，并為后續(xù)采用主成分分析（PCA）和 t-分布隨機(jī)鄰域嵌入（t-SNE）進(jìn)行高維數(shù)據(jù)分析提供可靠的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
 

HoloMonitor M4
 
1. 細(xì)胞培養(yǎng)與數(shù)字全息成像分析
實(shí)驗(yàn)采用MCF10A（ATCC CRL-10317）和 MDA-MB-231（ATCC HTB-26）細(xì)胞系。MCF10A 細(xì)胞培養(yǎng)于添加了 BPE、hEGF、胰島素、氫化可的松和 GA-1000（瑞士巴塞爾 Lonza 公司）的 MEBM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中；MDA-MB-231 細(xì)胞則培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清、5% 青霉素/鏈霉素及 1 mg/mL 胰島素（美國(guó) Gibco 公司）的 RPMI1640 培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞均在 37℃、5% CO₂條件下培養(yǎng)至約 50% 融合度。
細(xì)胞接種24小時(shí)后，使用HoloMonitor M4系統(tǒng)以每15分鐘一次的頻率采集延時(shí)圖像，解析細(xì)胞形態(tài)的動(dòng)態(tài)變化（包括面積、運(yùn)動(dòng)性和不規(guī)則性等參數(shù)）。通過特征特異性散點(diǎn)圖評(píng)估時(shí)間模式，并應(yīng)用獨(dú)立的雙樣本t 檢驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞系之間隨時(shí)間的顯著性差異。利用 PCA 和 t-SNE 方法實(shí)現(xiàn)高維數(shù)據(jù)的可視化聚類與趨勢(shì)識(shí)別。每個(gè)培養(yǎng)孔的圖像經(jīng)分割識(shí)別后，通過 HStudio 軟件的細(xì)胞計(jì)數(shù)功能確定細(xì)胞數(shù)量。
2. 數(shù)據(jù)收集與處理
通過HoloMonitor M4活細(xì)胞成像系統(tǒng)，實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記地獲取細(xì)胞的多維度動(dòng)態(tài)參數(shù)，包括細(xì)胞面積、形態(tài)不規(guī)則度、遷移力、運(yùn)動(dòng)性、遷移方向性以及光學(xué)厚度等關(guān)鍵指標(biāo)。原始數(shù)據(jù)通過pandas.read_excel()函數(shù)導(dǎo)入Python環(huán)境，并執(zhí)行數(shù)據(jù)清洗與標(biāo)準(zhǔn)化操作，以確保后續(xù)分析的準(zhǔn)確性與一致性。隨后采用主成分分析（PCA）與 t-分布隨機(jī)鄰域嵌入（t-SNE）相結(jié)合的策略進(jìn)行降維分析，以揭示細(xì)胞系間的差異模式。最后，借助scipy.stats.ttest_ind()函數(shù)對(duì)兩組細(xì)胞樣本執(zhí)行雙樣本t檢驗(yàn)，以量化評(píng)估其在各項(xiàng)特征參數(shù)上的顯著性差異。所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果經(jīng)系統(tǒng)整合后導(dǎo)出，為后續(xù)生物學(xué)解讀提供數(shù)據(jù)支持。
 
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
 
多維尺度分析揭示致癌性與三陰性乳腺癌細(xì)胞系特征
研究結(jié)果顯示，MCF10A 和 MDA-MB-231 細(xì)胞系之間存在顯著的形態(tài)學(xué)差異。具體而言，MDA-MB-231 細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)性，細(xì)胞尺寸更小且變異性更高，這些特性可能增強(qiáng)其侵襲潛能。相比之下，MCF10A 細(xì)胞具有更大的細(xì)胞尺寸和更規(guī)則的遷移模式，提示其在組織結(jié)構(gòu)環(huán)境中保持穩(wěn)定。此外，延時(shí)成像分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，MDA-MB-231 細(xì)胞的光學(xué)厚度和不規(guī)則性持續(xù)較高，這可能與其惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性有關(guān)。相關(guān)性分析進(jìn)一步支持上述發(fā)現(xiàn)，揭示了細(xì)胞大小、運(yùn)動(dòng)性和光學(xué)特性之間的內(nèi)在聯(lián)系，這些關(guān)聯(lián)對(duì)于理解細(xì)胞在微環(huán)境中的行為具有重要意義。
 

圖1 . MCF10A與MDA-MB-231細(xì)胞系的數(shù)字全息成像
圖像展示了細(xì)胞形態(tài)的3D形貌表征，其中彩色編碼的高度圖表示光學(xué)厚度（單位：微米）。暖色調(diào)（紅色和黃色）對(duì)應(yīng)較高光學(xué)厚度區(qū)域，而冷色調(diào)（藍(lán)色）表示較低光學(xué)厚度區(qū)域。左圖為非腫瘤源性MCF10A細(xì)胞，右圖為三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞。比例尺代表100微米。這些圖像凸顯了兩種細(xì)胞系在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上的差異。
 

圖S1.（A）MCF10A與（B）MDA-MB-231細(xì)胞的數(shù)字全息顯微鏡（DHM）圖像
圖中疊加了經(jīng)計(jì)算分割的細(xì)胞邊界。細(xì)胞邊界通過基于梯度的邊緣檢測(cè)算法從原始相移圖中提取，在保持DHM無(wú)標(biāo)記成像特性的同時(shí)增強(qiáng)了圖像的可解釋性。本圖作為對(duì)圖1的補(bǔ)充，提供了更清晰的單細(xì)胞輪廓可視化效果。
 

圖2.MCF10A與MDA-MB-231細(xì)胞的主成分分析（PCA）與t-SNE分布圖
每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，黑色點(diǎn)表示MCF10A細(xì)胞，紅色點(diǎn)表示MDA-MB-231細(xì)胞。（A）PCA圖中，x軸和y軸分別代表第一和第二主成分；（B）t-SNE圖中，x軸和y軸表示t-SNE的兩個(gè)特征維度。
 
研究結(jié)論 
在區(qū)分非腫瘤源性細(xì)胞與三陰性乳腺癌（TNBC）細(xì)胞系方面，目前大部分采用流式細(xì)胞術(shù)、熒光顯微鏡或者基因檢測(cè)與蛋白質(zhì)組學(xué)等分析技術(shù)。這些方法雖能有效識(shí)別特定細(xì)胞標(biāo)志物或分子通路，但通常需要熒光標(biāo)記、基因測(cè)序或復(fù)雜的樣本前處理，這些干預(yù)可能改變細(xì)胞自然行為或限制對(duì)細(xì)胞的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)能力。
本研究采用全息活細(xì)胞成像系統(tǒng) HoloMonitor M4，結(jié)合主成分分析（PCA）和 t-分布隨機(jī)鄰域嵌入（t-SNE）等先進(jìn)數(shù)據(jù)分析策略，展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。作為一種無(wú)標(biāo)記成像技術(shù)，HoloMonitor M4可在接近生理?xiàng)l件下維持活細(xì)胞的完整性，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和形態(tài)變化等行為的長(zhǎng)時(shí)程追蹤。這種方法不僅增強(qiáng)了對(duì)動(dòng)態(tài)細(xì)胞過程的解析能力，還有助于在最小干擾下識(shí)別新的生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。通過HoloMonitor M4與多變量關(guān)聯(lián)分析，本研究進(jìn)一步深化了對(duì)細(xì)胞自適應(yīng)機(jī)制及其與微環(huán)境互作的理解，為揭示調(diào)控癌細(xì)胞行為的內(nèi)在與外在因素提供了重要線索。實(shí)驗(yàn)不僅明確了非腫瘤源性細(xì)胞與TNBC細(xì)胞之間的本質(zhì)差異，也提示了潛在的生物標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)。
隨著乳腺癌研究邁向精準(zhǔn)醫(yī)療，解析不同亞型在細(xì)胞和分子層面的特異性至關(guān)重要。本文的創(chuàng)新發(fā)現(xiàn)為理解三陰性乳腺癌的侵襲性本質(zhì)提供了新穎視角，奠定了基礎(chǔ)研究框架，對(duì)最終減輕該疾病對(duì)患者的健康危害具有重大意義。