TurboKnockout基因編輯技術(shù)應(yīng)用:從ES細(xì)胞打靶到100%嵌合Founder小鼠

賽業(yè)生物在傳統(tǒng)ES打靶技術(shù)的基礎(chǔ)上，研發(fā)出了升級(jí)版的TurboKnockout^®基因編輯技術(shù)，利用優(yōu)化的純合ES克隆打靶體系，可篩選基因敲除、敲入、點(diǎn)突變的純合ES細(xì)胞。該技術(shù)結(jié)合了囊胚前注射和四倍體補(bǔ)償技術(shù)進(jìn)行顯微注射，確保產(chǎn)生的Founder小鼠達(dá)到100%嵌合狀態(tài)，所有組織細(xì)胞均完全由外源ES細(xì)胞分化發(fā)育而來(lái)，解決了傳統(tǒng)技術(shù)中嵌合體比例不穩(wěn)定的問(wèn)題。基因編輯周期快至3個(gè)月，可大批量獲得基因一致的純合子小鼠。
 

TurboKnockout^®技術(shù) 100%嵌合率的驗(yàn)證數(shù)據(jù)

該項(xiàng)技術(shù)的穩(wěn)定性經(jīng)過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)得到了驗(yàn)證，流程為：載體構(gòu)建→ES打靶→PCR/FACS驗(yàn)證→陽(yáng)性胚胎制作→“100%”嵌合F0胚胎及小鼠生產(chǎn)→嵌合率驗(yàn)證。

首先我們構(gòu)建了Rosa26安全位點(diǎn)過(guò)表達(dá)載體CAG>Luciferase>EGFP質(zhì)粒，在C57BL/6N WT ES細(xì)胞上獲得了PCR正確的陽(yáng)性克隆，之后通過(guò)流式驗(yàn)證EGFP正確表達(dá)。
 

載體構(gòu)建、ES克隆篩選及EGFP表達(dá)檢測(cè)

我們將上面獲得的陽(yáng)性ES克隆通過(guò)顯微注射獲得陽(yáng)性Founder小鼠，繼而通過(guò)常規(guī)傳代獲得純合F2代雄鼠。把F2雄鼠和C57BL/6N WT雌鼠配繁產(chǎn)生可用于TurboKnockout^®技術(shù)顯微注射的陽(yáng)性受體胚胎，通過(guò)在該背景胚胎顯微注射C57BL/6N WT的ES細(xì)胞和未注射ES細(xì)胞的空扎受體胚胎，分別產(chǎn)生12.5d胚胎及4周齡的Founder小鼠，驗(yàn)證Founder小鼠Luciferase和EGFP的表達(dá)情況。

結(jié)果顯示，12.5d的空扎胚胎（圖2.A）相對(duì)于注射了C57BL/6N WT ES細(xì)胞的胚胎（圖2.B）有明顯的EGFP表達(dá)，將胚胎通過(guò)胰酶和DNA酶解離為單細(xì)胞后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，空扎胚胎相對(duì)注射了C57BL/6N WT ES細(xì)胞的胚胎EGFP也是全部表達(dá)的，且注射了C57BL/6N WT ES細(xì)胞的胚胎未檢測(cè)到EGFP陽(yáng)性細(xì)胞泄露表達(dá)。

12.5d胚胎EGFP熒光拍照及流式檢測(cè)

空扎胚胎和注射了WT ES細(xì)胞的胚胎分別移植ICR代孕鼠出生的Founder鼠到4周齡后，分別對(duì)2種小鼠做了活體成像，結(jié)果顯示注射了C57BL/6N WT ES細(xì)胞的胚胎未見(jiàn)Luciferase熒光泄露表達(dá)（圖3.B），同時(shí)空扎的胚胎發(fā)育而來(lái)的小鼠表現(xiàn)為L(zhǎng)uciferase強(qiáng)熒光（圖3.A），且差異極顯著（圖3.C P=0.0074）。

4周齡Founder鼠活體成像結(jié)果

為進(jìn)一步驗(yàn)證注射了C57BL/6N WT ES細(xì)胞的胚胎是否有CAG>Luciferase>EGFP細(xì)胞嵌合，分別對(duì)注射了WT ES細(xì)胞的4周齡小鼠取材心、肝、脾、肺、腎和12.5d胚胎組織進(jìn)行PCR驗(yàn)證，同時(shí)添加空扎胚胎做為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果注射了C57BL/6N WT ES細(xì)胞的F0小鼠各組織和胚胎均未檢測(cè)到MT條帶。

4周齡Founder鼠和12.5d胚胎PCR鑒定

（1-5：注射WT ES 1鼠的心、肝、脾、肺、腎；6-10：注射WT ES 2鼠的心、肝、脾、肺、腎；11-15：注射WT ES 3鼠的心、肝、脾、肺、腎；16-21：注射WT ES 12.5d胚胎組織；22-25：12.5d的空扎胚胎組織；26：WT對(duì)照；圖中加了700bp內(nèi)參）

總結(jié)：TurboKnockout^®技術(shù)生產(chǎn)的Founder小鼠為100%嵌合狀態(tài)，所有Founder小鼠的組織細(xì)胞均由外源ES細(xì)胞分化發(fā)育而來(lái)。

TurboKnockout^®基因編輯技術(shù)優(yōu)勢(shì)

1.編輯類型多樣化：可進(jìn)行基因敲除、敲入、點(diǎn)突變或人源化等多種項(xiàng)目類型的基因修飾；
2.QC體系多樣化：細(xì)胞階段除了可進(jìn)行除常規(guī)PCR鑒定外，還可以通過(guò)多種手段質(zhì)檢（QC）ES克隆打靶的準(zhǔn)確性，包括染色體核型鑒定、Southern Blot鑒定、qPCR鑒定、FACS鑒定等表達(dá)檢測(cè)；
3.F0基因型穩(wěn)定：結(jié)合賽業(yè)生物專利：TurboKnock顯微注射技術(shù)和四倍體補(bǔ)償技術(shù)，保障交付的所有F0代小鼠的基因型一致，基因修飾準(zhǔn)確、效果穩(wěn)定；
4.品系選擇靈活：賽業(yè)生物可提供C57BL/6NCya、C57BL/6JCya、BALB/cAnCya、129S2/SvPasCya等多品系選擇。

TurboKnockout^®基因編輯小鼠模型

HUGO-GT^®全基因組人源化模型列表（精選）

2.HUGO-Ab^®全人源抗體小鼠
基于創(chuàng)新性全人抗體藥物研發(fā)的需求，賽業(yè)生物憑借扎實(shí)的技術(shù)創(chuàng)新實(shí)力以及自主研發(fā)的TurboKnockout^® ES打靶技術(shù)，構(gòu)建了下一代HUGO-Ab^®全人源抗體小鼠，攜帶了全套人類免疫球蛋白基因，能夠在體內(nèi)產(chǎn)生具有高親和力和低免疫原性的全人源抗體。系列產(chǎn)品包含HUGO-Mab™全人單克隆抗體小鼠、HUGO-Light™全人共輕鏈抗體小鼠和HUGO-Nano™全人納米抗體小鼠，擁有豐富的抗體序列多樣性，包含全部的人源抗體重鏈、Kappa和Lambda輕鏈可變區(qū)germline基因，其卓越的性能在抗體發(fā)現(xiàn)過(guò)程中展現(xiàn)出良好的效果，得到多家跨國(guó)藥企、生物制藥公司和學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)的認(rèn)可，為治療性抗體新藥提供了高效的研發(fā)引擎。

此外，賽業(yè)生物還提供多種基因編輯定制服務(wù)，包括完全性基因敲除小鼠、條件性基因敲除小鼠、基因敲入小鼠以及利用KO-First技術(shù)靈活構(gòu)建完全性或條件性敲除小鼠，以滿足不同研究需求，為藥物篩選、信號(hào)通路分析和遺傳機(jī)制解析提供高效工具。