小鼠模型在褪黑素通過腸肝軸改善膽汁淤積性肝病研究中的應用

膽汁淤積性肝病是一種慢性肝膽疾病，其發(fā)病機制的核心原因是膽汁酸（BA）的過度積累，可導致肝細胞壞死、進行性肝纖維化和終末期肝病。因此，發(fā)現(xiàn)新的治療藥物及機制對于治療膽汁淤積性肝病具有重要意義。

2023年11月8日，南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院臨床獸醫(yī)學黃克和教授團隊在《Journal of Pineal Research》（IF8.3）發(fā)表題為“Melatonin improves cholestatic liver disease via the gut‐liver axis”的研究論文，南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院博士研究生劉鮮姣為文章第一作者，南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院青年教師劉云歡、陳興祥教授為文章通訊作者。南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院臨床獸醫(yī)學動物營養(yǎng)與健康實驗室為該研究提供了技術和平臺支持。

該研究通過小鼠動物實驗，闡明了褪黑素（MT）通過重塑腸道微生物群和激活腸道FXR/FGF - 15軸介導的抑制小鼠肝臟膽汁酸合成并促進膽汁酸排泄來改善膽汁淤積性肝病，這表明MT治療是預防和治療膽汁淤積性肝病以及與膽汁代謝失調(diào)相關的其他疾病的有效方法。

圖片來源：《Journal of Pineal Research》
https://onlinelibrary.wiley.com/toc/1600079x/2024/76/2

1 研究材料及方法
在該研究中，主要研究材料包括3,5-二乙氧羰基-1,4-二氫-2,4,6-三甲吡啶(DDC)、C57BL/6 J小鼠、腸上皮細胞特異性法尼醇受體（FXR）基因標記（Fxr^fl/fl）小鼠、腸上皮細胞特異性FXR基因敲除（Fxr^△IE）小鼠，MDR^{2- / -}小鼠。其中腸上皮細胞特異性FXR基因標記（Fxr^fl/fl）小鼠和腸上皮細胞特異性FXR基因敲除（Fxr^△IE）小鼠由賽業(yè)生物提供。

該研究采用了16SrRNA基因測序分析、免疫熒光染色、糞菌移植、RT-qPCR、western-blotting等試驗方法和技術。

2 技術路線

MT對DDC喂養(yǎng)小鼠肝損傷的緩解效果分析
↓
Abx處理的DDC喂養(yǎng)小鼠中MT的效果分析
↓
糞菌移植試驗
↓
Fxr△IE小鼠中MT的效果分析
↓
MDR^{2- / -}小鼠中MT的效果分析

3 研究結果

 
MT改善了DDC喂養(yǎng)小鼠肝臟損傷

MT處理降低了DDC喂養(yǎng)小鼠肝臟血清生化指標（AST，ALT和ALP）、肝臟細胞角蛋白19 (CK-19)的表達水平、肝臟纖維化指標（α‐SMA，Collagen‐I, Tgf‐β和TIMP‐1），降低了肝臟炎癥標記物的表達水平（TNF-α、IL-6和IL-1β）。這些結果表明MT減輕了DDC喂養(yǎng)小鼠的肝損傷和纖維化，并改善了肝細胞壞死和肝小管增生。

MT改變了DDC喂養(yǎng)小鼠腸道菌群

接下來，研究人員通過16S rRNA基因測序法證實了MT改善了DDC喂養(yǎng)小鼠的腸道微生物群的多樣性，顯著增加了DDC喂養(yǎng)小鼠腸道中厚壁菌門的相對豐度，降低了疣微菌門和變形菌門的豐度，增加了XlVa梭狀芽胞桿菌(Clostridium_XlVa)和乳酸桿菌（Lactobacillus）的相對豐度，降低了埃希氏菌和阿克曼氏菌的豐度。值得注意的是，MT顯著提高了DDC喂養(yǎng)小鼠腸道內(nèi)厚壁菌門(富含糞膽鹽水解酶（BSH）活性高的細菌)的水平和糞便的BSH活性。該結果表明，MT改善了肝纖維化，這可能有助于重編DDC喂養(yǎng)小鼠腸道微生物群，增加糞便BSH活性。

MT抑制DDC喂養(yǎng)小鼠體內(nèi)BA合成并促進BA排泄

MT處理的DDC喂養(yǎng)小鼠體內(nèi)BA代謝分析結果表明，MT降低了DDC喂養(yǎng)小鼠血清、肝臟、腸道和總BA的水平，升高了糞便中的BA水平。代謝組學分析顯示，DDC喂養(yǎng)小鼠的腸道結合膽汁酸水平(T-βMCA、T-αMCA和TUDCA)顯著升高，MT處理后顯著降低。此外，MT逆轉了DDC喂養(yǎng)小鼠中回腸FXR、SHP和FGF-15 mRNA的表達水平和血清FGF-15水平。有趣的是，DDC喂養(yǎng)小鼠肝臟CYP7A1（BA合成限速酶）蛋白和mRNA水平顯著升高，而MT處理后顯著降低。這表明MT是通過上調(diào)腸道FXR/FGF-15軸的表達來減少DDC喂養(yǎng)小鼠肝臟BA合成。

MT在Abx預處理小鼠中無法發(fā)揮肝臟保護作用

為確定腸道微生物群在MT對DDC誘導的肝損傷和纖維化的保護作用中的角色，研究人員采用抗生素（Abx）預處理實驗小鼠。結果表明，Abx預處理小鼠血清ALT、AST和ALP水平顯著升高，肝損傷和纖維化明顯上調(diào)。此外，Abx預處理小鼠回腸FXR、SHP和FGF-15的mRNA表達明顯降低，血清FGF-15水平也顯著降低，肝臟CYP7A1 mRNA表達上調(diào)，血清、肝臟和總BA水平均上調(diào)，可見，MT在Abx預處理小鼠中未能發(fā)揮改善肝損傷的作用，證明MT對DDC誘導的肝纖維化的緩解作用以及對BA合成的抑制作用是由腸道微生物群介導的。

MT處理小鼠糞菌移植后仍對肝臟具有保護作用

為進一步驗證腸道微生物在MT改善DDC小鼠肝損傷過程中的作用，研究人員進行了糞菌移植試驗。結果表明，與FMT (DDC)組相比，F(xiàn)MT (DDC+MT)小鼠的肝損傷和纖維化減輕了，血清ALT、AST和ALP水平也降低，回腸FXR、SHP和FGF-15的mRNA表達顯著上調(diào)，血清FGF-15水平也明顯上調(diào)，而肝臟CYP7A1 mRNA表達降低。此外，F(xiàn)MT (DDC+MT)組小鼠血清、肝臟和總BA水平均降低了。該結果再次證明了腸道菌群介導了MT對DDC誘導的肝損傷的改善作用和對BA的抑制作用。

FXR基因缺失消除了MT對DDC導致的肝損傷的保護作用

接下來研究人員采用FXR基因敲除小鼠（Fxr^△IE小鼠，由自賽業(yè)生物提供）進一步驗證腸道FXR在MT對小鼠肝損傷保護作用中的作用。與Fxr^fl/fl小鼠相比，DDC喂養(yǎng)顯著增加了Fxr^△IE小鼠的肝損傷和纖維化。MT對肝損傷和纖維化的保護作用在Fxr^△IE小鼠小鼠中消失，但在Fxr^fl/fl小鼠中依然有效。同時，MT處理對DDC喂養(yǎng)的Fxr^△IE小鼠肝臟Cyp7a1 mRNA表達沒有影響。MT處理不能有效降低DDC喂養(yǎng)的Fxr^△IE小鼠的血清和肝臟BA水平以及總BA池大小。這表明腸道FXR在介導MT對DDC誘導的肝損傷和纖維化的改善作用中起著至關重要的作用。

MT通過抑制BA合成促進BA排泄改善Mdr2-/-小鼠肝損傷

最后，研究人員用Mdr2^-/-小鼠（膽汁淤積模型鼠）進一步闡明了MT對肝損傷和纖維化的保護作用及機制。結果表明，MT顯著降低Mdr2^-/-小鼠的肝臟血清生化指標，改善了肝損傷和纖維化。此外，MT還顯著降低Mdr2^-/-小鼠纖維化標記物和炎癥標記物的mRNA表達水平。該結果表明MT可改善Mdr^2-/-小鼠的肝損傷、炎癥和肝纖維化。

MT激活FXR受體改善膽汁淤積性肝損傷

如圖8所示，MT降低了Mdr2^-/-小鼠血清、肝臟、腸道中的BA水平和總BA池大小，顯著增加了Mdr2^-/-小鼠的糞便BA水平。MT顯著降低肝臟CYP7A1蛋白和mRNA的表達。同時，MT處理顯著降低了Mdr2^-/-小鼠肝臟Fxr和Shp mRNA的表達，但顯著增加了回腸Fxr和Shp mRNA的表達，也顯著提高了血清和回腸FGF-15 mRNA水平。該結果表明MT減少了Mdr2^-/-小鼠肝臟BA合成并增強了BA排泄，該結果與DDC喂養(yǎng)小鼠中的結果一致。

結論
綜上所述，MT通過重塑腸道微生物群，改變腸道BAs組成，激活FXR/FGF-15軸，從而抑制肝臟BA合成，促進糞便BA排泄，從而預防膽汁淤積性肝病(圖8G)。這表明MT治療是預防和治療膽汁淤積性肝病的有效方法，同時也可能治療其他與BA失調(diào)相關的疾病。

原文檢索：
Xianjiao Liu，Jinyan Li，Mengdie Shi，Jun Fu，Yubo Wang，Weili Kang，Jinyan Liu，F(xiàn)enxia Zhu，Kehe Huang，Xingxiang Chen，Yunhuan Liu.Melatonin improves cholestatic liver disease via the gut‐liver axis[J]