文獻(xiàn)解讀：FBL通過募集YY1增強(qiáng)CAD基因表達(dá)促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展

肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的肝癌類型，其發(fā)生率在所有腫瘤中排名第六，死亡率居第三位，對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1]。作為一種高度異質(zhì)化的惡性腫瘤，原發(fā)性肝癌在臨床上存在著多種挑戰(zhàn)，其中一個(gè)關(guān)鍵問題是其早期診斷的困難。大部分患者在疾病早期難以被及時(shí)診斷，往往直到病情進(jìn)展到晚期才被確診，錯(cuò)過了最佳治療時(shí)機(jī)。這不僅限制了治療手段的選擇，還導(dǎo)致了較差的預(yù)后結(jié)果。如果能在早期診斷肝癌，患者的預(yù)后會(huì)顯著改善，且5年生存率通常超過70 %。然而，由于大多數(shù)患者在疾病晚期才被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致5年總生存率小于16 %。索拉非尼（Sorafenib）是首個(gè)被證實(shí)對(duì)晚期HCC有效的治療藥物，已成為標(biāo)準(zhǔn)治療方案超過十年。然而，盡管索拉非尼在臨床應(yīng)用中取得了一定的療效，其治療效果仍有限，與安慰劑相比，索拉非尼僅能將HCC患者的生存期延長(zhǎng)2.8個(gè)月。近年來，隨著免疫檢查點(diǎn)抑制劑（Immune Checkpoint Inhibitor, ICI）聯(lián)合療法的應(yīng)用，晚期HCC的治療迎來了新的突破。盡管取得了這些進(jìn)展，但復(fù)發(fā)性、新發(fā)型HCC腫瘤發(fā)展到無法治愈的晚期階段的比例仍然很高。因此，尋找HCC新的靶點(diǎn)仍是臨床急需解決的問題。

研究表明，肝臟腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展與表觀遺傳學(xué)有著密切的關(guān)系。在HCC中，常見的表觀遺傳異常包括DNA甲基化、組蛋白修飾變化、miRNA表達(dá)紊亂以及相關(guān)基因的表達(dá)失調(diào)。通過靶向表觀遺傳機(jī)制的治療策略，能夠糾正這些異�；�因表達(dá)，從而有效抑制HCC的發(fā)生和進(jìn)展。組蛋白修飾是肝癌研究中表觀遺傳調(diào)控的關(guān)鍵機(jī)制之一，已引起了廣泛的關(guān)注。本研究旨在篩選對(duì)HCC腫瘤發(fā)生及進(jìn)展具有重要作用的表觀遺傳調(diào)控因子，為HCC的靶向治療提供理論依據(jù)。

我們基于TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌（LIHC）樣本的差異表達(dá)基因，進(jìn)行了系統(tǒng)的表觀遺傳學(xué)分析，篩選出Fibrillarin（FBL）作為關(guān)鍵候選基因。FBL是一種rRNA 2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶，我們發(fā)現(xiàn)其在HCC中具有重要的促癌作用。通過一系列體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn)，我們深入探究了FBL的潛在機(jī)制。體外實(shí)驗(yàn)顯示，敲低FBL顯著抑制HCC細(xì)胞的增殖。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，我們構(gòu)建了細(xì)胞源性異種移植（CDX）、患者源性異種移植（PDX）模型以及Fbl肝特異性敲除小鼠的二乙基亞硝胺（DEN）誘導(dǎo)性HCC模型，結(jié)果均證實(shí)FBL在HCC發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。機(jī)制研究表明，F(xiàn)BL通過招募轉(zhuǎn)錄因子YY1至CAD啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控CAD的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)HCC發(fā)展。此外，我們還發(fā)現(xiàn)氟達(dá)拉濱磷酸鹽是FBL的一個(gè)新型抑制劑，能夠在體內(nèi)外有效抑制HCC生長(zhǎng)。更重要的是，氟達(dá)拉濱磷酸鹽與多吉美（lenvatinib）聯(lián)用，展現(xiàn)出協(xié)同增強(qiáng)的抗腫瘤活性。本研究揭示了FBL-YY1-CAD通路在HCC中的促癌作用，并首次提出氟達(dá)拉濱磷酸鹽作為FBL的潛在抑制劑，具有良好的應(yīng)用前景。

本研究使用賽業(yè)生物的NOD-SCID小鼠構(gòu)建了HCC人源性組織異種移植瘤（PDX）小鼠模型，結(jié)合病毒液注射實(shí)現(xiàn)FBL的瘤內(nèi)敲減，為證明FBL能夠調(diào)控HCC腫瘤生長(zhǎng)提供了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究還利用該P(yáng)DX模型的腫瘤進(jìn)行了IHC分析、Western blot代謝物分析，從體內(nèi)模型中證實(shí)了HCC對(duì)CAD基因的表達(dá)調(diào)控作用。

研究方法:
該研究中采用了多項(xiàng)技術(shù)，包括Western bloting，免疫組化，細(xì)胞流式分析，細(xì)胞周期，定量PCR等基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，在探究FBL下游分子通路時(shí)，還運(yùn)用了CUT & RUN和ATCC等測(cè)序研究方法。對(duì)測(cè)序結(jié)果篩選的下游信號(hào)通路，利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（液相色譜）檢測(cè)技術(shù)和Western blot進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證。

技術(shù)路線圖1：

技術(shù)路線圖2：

研究結(jié)果
1. FBL在HCC中高表達(dá)并且和患者生存期相關(guān)
我們通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫中與肝癌相關(guān)的數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)方法篩選出肝癌組織與正常組織之間的差異表達(dá)基因。隨后，利用RT-qPCR在7對(duì)人肝癌組織及其對(duì)應(yīng)的正常組織中對(duì)59個(gè)候選基因進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FBL在肝癌組織中顯著高表達(dá)（圖1左）。進(jìn)一步通過肝癌組織芯片及患者臨床樣本的檢測(cè)，證實(shí)FBL在HCC中呈現(xiàn)出一致的高表達(dá)趨勢(shì)，并與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)（圖1右）。

通過TCGA數(shù)據(jù)庫篩選出FBL在肝癌組織中顯著高表達(dá)（左圖A-F）;通過肝癌組織芯片確定FBL在肝癌患者中顯著高表達(dá)并且和生存期相關(guān)（右圖A-J）。

2. 敲減FBL抑制肝癌細(xì)胞的增殖和腫瘤生長(zhǎng)
在HCC細(xì)胞中敲減FBL后，細(xì)胞的增殖能力和軟瓊脂克隆形成能力顯著下降。相反，F(xiàn)BL蛋白表達(dá)上調(diào)則明顯增強(qiáng)了HepG2細(xì)胞的增殖和克隆形成能力。此外，在FBL敲減的HCC細(xì)胞移植瘤模型中，腫瘤生長(zhǎng)被顯著抑制，進(jìn)一步驗(yàn)證了FBL在HCC發(fā)生發(fā)展中的促癌作用。

敲減FBL抑制肝癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)

3. CAD是FBL的下游基因
通過分析數(shù)據(jù)庫中CAD基因與FBL蛋白和mRNA表達(dá)的相關(guān)性，我們發(fā)現(xiàn)CAD與FBL的表達(dá)呈較高的相關(guān)性，并且與預(yù)后相關(guān)性最為顯著。通過RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)，敲減FBL后的HCC細(xì)胞中CAD的mRNA和蛋白水平顯著下調(diào)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，F(xiàn)BL敲減的細(xì)胞中CAD的熒光強(qiáng)度明顯降低。

FBL通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控CAD的表達(dá)，進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞內(nèi)UMP的合成及細(xì)胞周期的進(jìn)程。

4. FBL和轉(zhuǎn)錄因子YY1互作調(diào)節(jié)CAD的表達(dá)
通過質(zhì)譜（Mass Spectrometry，MS）篩選，發(fā)現(xiàn)YY1可能與FBL蛋白相互作用，Co-IP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了FBL與YY1的體外相互作用。RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)表明，CAD的mRNA和蛋白質(zhì)水平在敲減YY1后明顯下降。ChIP-PCR實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)BL和YY1均能結(jié)合到CAD啟動(dòng)子的YY1結(jié)合位點(diǎn)。熒光酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明，敲減FBL對(duì)轉(zhuǎn)錄因子YY1的轉(zhuǎn)錄活性有明顯的影響。通過9aaTAD軟件預(yù)測(cè)，F(xiàn)BL含有一段轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明該區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄激活功能，并且通過SPR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證FBL-TAD蛋白可以與YY1互作，從而影響YY1的轉(zhuǎn)錄活性。

FBL可以和轉(zhuǎn)錄因子YY1蛋白結(jié)合（左圖A-M）;FBL通過隱藏的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（TAD）和YY1結(jié)合從而調(diào)控CAD表達(dá)（右圖A-I）。

5. PDX模型和EDN肝癌模型，驗(yàn)證FBL缺失抑制腫瘤發(fā)展
通過瘤內(nèi)注射FBL敲減病毒濃縮液，在PDX模型中實(shí)現(xiàn)FBL蛋白的下調(diào)，證明FBL敲減顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。DEN誘導(dǎo)的肝癌模型結(jié)果顯示，F(xiàn)BL敲除可以有效抑制肝癌的發(fā)生與發(fā)展。IHC和Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)BL敲減組PDX腫瘤中的CAD水平顯著低于對(duì)照組。

 PDX模型和基因敲除鼠模型研究FBL對(duì)HCC的發(fā)生發(fā)展的作用

6. 氟達(dá)拉濱磷酸鹽與樂伐替尼協(xié)同抑制肝癌發(fā)展
基于FBL蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，從化合物庫中篩選出特異性靶向 FBL的抑制劑氟達(dá)拉濱磷酸鹽。進(jìn)一步通過MTT實(shí)驗(yàn)和平板克隆實(shí)驗(yàn)證實(shí)，氟達(dá)拉濱磷酸鹽能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖。通過熱位移實(shí)驗(yàn)、SPR和IP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了氟達(dá)拉濱磷酸鹽與FBL的結(jié)合。氟達(dá)拉濱磷酸鹽作為FBL抑制劑，與樂伐替尼聯(lián)合應(yīng)用，能夠顯著抑制肝癌的進(jìn)展。

氟達(dá)拉濱磷酸鹽是FBL的抑制劑，并且與樂伐替尼協(xié)同抑制肝癌發(fā)展

結(jié)論
綜上所述，本研究在HCC患者腫瘤組織中觀察到FBL蛋白質(zhì)水平顯著上升。通過CDX、PDX、DEN誘導(dǎo)的FBL肝臟特異性敲除小鼠肝癌模型的體內(nèi)研究顯示，F(xiàn)BL在HCC的發(fā)生和進(jìn)展過程中扮演著關(guān)鍵的角色。我們發(fā)現(xiàn)FBL與CAD mRNA和蛋白水平之間存在顯著的正相關(guān)，且CAD的表達(dá)受FBL和轉(zhuǎn)錄因子YY1的共同調(diào)控。我們篩選并驗(yàn)證了氟達(dá)拉濱磷酸鹽作為一種新型FBL抑制劑，能夠顯著抑制HCC體內(nèi)外的生長(zhǎng)。我們的研究強(qiáng)調(diào)了FBL-YY1-CAD軸在HCC中的促癌作用。